1 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（1） 行為學(xué)評價(jià)：

① 獎(jiǎng)勵(lì)性條件反射實(shí)驗(yàn)

鼻觸次數(shù)：動(dòng)物經(jīng)過訓(xùn)練后形成信號(hào)燈亮與獎(jiǎng)賞物質(zhì)之間條件反射，屬于巴普洛夫經(jīng)典條件反射范疇，反映了學(xué)習(xí)、理解、推理等方面的認(rèn)知功能。造模成功動(dòng)物鼻觸次數(shù)顯著降低。

② 水迷宮實(shí)驗(yàn)

逃避潛伏期和總游程：定航能力評價(jià)指標(biāo)，反映動(dòng)物空間參考記憶。造模成功動(dòng)物逃避潛伏期和總游程顯著增加。

穿臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限游程：探索能力的評價(jià)指標(biāo)，反映動(dòng)物空間參考記憶。造模成功動(dòng)物穿臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限游程顯著降低。

③穿梭實(shí)驗(yàn)

主動(dòng)穿梭次數(shù)、被動(dòng)穿梭次數(shù)、安全區(qū)時(shí)間：反映動(dòng)物聯(lián)想學(xué)習(xí)記憶能力。模型動(dòng)物主動(dòng)穿梭次數(shù)和安全區(qū)時(shí)間顯著性降低。

（2）分子生物學(xué)評價(jià)：

①HPA軸相關(guān)指標(biāo)檢測

皮質(zhì)酮、ACTH兩種激素水平：皮質(zhì)酮和ACTH是由HPA軸釋放的激素，其水平高低反映HPA軸的功能。模型動(dòng)物皮質(zhì)酮、ACTH兩種激素水平顯著高于正常動(dòng)物，顯示出HPA軸的亢進(jìn)。

② 蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

CREB和BDNF蛋白表達(dá)量：與神經(jīng)元細(xì)胞的生長和發(fā)育及突觸可塑性密切相關(guān)。模擬失重組動(dòng)物海馬CREB和BDNF蛋白表達(dá)量降低，顯示其海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶的損傷。

2 技術(shù)難點(diǎn)

（1）尋找適當(dāng)角度并選擇正確的綁尾方式，保證造模成功的同時(shí)盡可能降低對動(dòng)物機(jī)體的損傷。

（2） 建立無人實(shí)時(shí)監(jiān)控裝置，降低動(dòng)物的尾吊狀態(tài)未知性，以及時(shí)糾正脫落或體態(tài)改變的動(dòng)物。

3 總結(jié)

經(jīng)過兩周以上的尾部懸吊可誘導(dǎo)大鼠（Wistar大鼠、SD大鼠）學(xué)習(xí)記憶障礙，可作為特因環(huán)境下失重模擬誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶障礙的方法。與其他應(yīng)激方式不同，尾部懸吊針對于航天特因環(huán)境下的應(yīng)激，并很好地模擬了失重效應(yīng)。通過尾部懸吊的方式建立模擬失重記憶障礙模型，發(fā)揮地面模擬實(shí)驗(yàn)的重要作用，為航天特因環(huán)境下，學(xué)習(xí)記憶障礙機(jī)理研究、防護(hù)和藥物研究提供客觀穩(wěn)定的動(dòng)物模型，為航天任務(wù)順利進(jìn)行提供科技支撐。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級大鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物用水均經(jīng)過除菌處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）藥品與試劑：

CORT Elisa試劑盒，ACTH Elisa 試劑盒，均購自美國Rapid BioLab公司。CREB(48H2) rabbit mAb（Cell Signaling）、PCREB (ser133) Antibody（Cell Signaling）、BDNF Antibody (N-20):sc-546（Santa Cruz Bio-technology）、Peroxidase-conjugated goat(anti-mouse)（北京普利萊生物技術(shù)有限公司）、Peroxidase-conjugatedgoat(anti -rabbit)Mouse anti-GAPDH antibody（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、Prestained Protein Ladder(40-300 kDa)（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）

（2）儀器：

①行為學(xué)檢測：大鼠水迷宮實(shí)時(shí)檢測系統(tǒng)、獎(jiǎng)勵(lì)性條件反射測試系統(tǒng)(均由北京鑫海華儀公司、中國航天員科研訓(xùn)練中心和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所聯(lián)合研制)

②分子生物學(xué)檢測：電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）、離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）、制冰機(jī)（意大利Icematic公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、超聲細(xì)胞破碎儀（美國Sonics公司）、TS-1脫色搖床（江蘇海門其林貝樂公司）、雙垂直板電泳槽（美國Bio-Rad公司）、Gel Doc XR凝膠成像（美國Bio-Rad公司）、移液槍（德國Eppendorf公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 評價(jià)方法

（1）行為學(xué)評價(jià):

①獎(jiǎng)勵(lì)性條件反射實(shí)驗(yàn):

利用獎(jiǎng)勵(lì)性條件反射測試系統(tǒng)，對造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行檢測。應(yīng)用自由適應(yīng)模式，此模式為信號(hào)燈亮，獎(jiǎng)賞物質(zhì)給出。以動(dòng)物探頭次數(shù)（NP）為評價(jià)指標(biāo)。動(dòng)物探頭喝水反應(yīng)了動(dòng)物對飲水盒的位置記憶與探索興趣程度，此階段訓(xùn)練的目的使動(dòng)物得到獎(jiǎng)賞物質(zhì)可在飲水盒內(nèi)獲得的信息；使動(dòng)物將信號(hào)燈亮與獎(jiǎng)賞物質(zhì)之間形成經(jīng)典條件反射。

②水迷宮實(shí)驗(yàn)

空間定航實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)期間，保持水溫在（23～25）℃，實(shí)驗(yàn)室物品及人員位置固定作為大鼠空間參照物。大鼠先放在位于第三象限內(nèi)的平臺(tái)上適應(yīng)15 s，然后分別從第一、二兩個(gè)象限放入迷宮中，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)間為90 s，后適應(yīng)15 s。訓(xùn)練動(dòng)物找到藏于水面的平臺(tái)并爬上平臺(tái)。將動(dòng)物入水到尋臺(tái)成功所需時(shí)間記作潛伏期。尋臺(tái)失敗潛伏期與實(shí)驗(yàn)設(shè)定時(shí)間相同。用潛伏期評價(jià)動(dòng)物空間定位學(xué)習(xí)能力。

空間探索實(shí)驗(yàn):定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日，拆除平臺(tái)，選擇第一象限作為入水象限，通過動(dòng)物在90 s內(nèi)穿過原平臺(tái)位置的次數(shù)、原平臺(tái)象限游程比率及時(shí)間比率（即動(dòng)物在原平臺(tái)象限的游程及時(shí)間占總游程及總時(shí)間的比率）來評價(jià)動(dòng)物的空間記憶能力。

（2）分子生物學(xué)檢測

①HPA軸相關(guān)指標(biāo)檢測

ELISA試劑盒法。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，操作步驟如下：試劑盒平衡至室溫（20-25℃）：拿出包被一抗的96孔酶標(biāo)板,并稀釋洗滌液：加入25μL血清標(biāo)本與相應(yīng)反應(yīng)孔中；每空加入200μL酶聯(lián)五，室溫下反應(yīng)60min；甩盡反應(yīng)液，用洗滌液洗板5次；每孔加入顯色液200uL，37℃下反應(yīng)15min；每孔加入終止液100L：15min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定450nm處波長的吸光度值。用半對數(shù)做圖法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,由此計(jì)算血清中激素濃度。靈敏度：ACTH2.5pg/ml，皮質(zhì)酮0.7nmol/L，批件差10%-15%。

② 蛋白含量檢測

（a）組織蛋白的提取

每組各3個(gè)海馬組織，稱重，每10mg組織加入100 μl預(yù)冷的裂解液；冰上超聲破碎，制成10%組織勻漿。再置冰上裂解30 min：將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，4℃離心（20min，12000 rpm/min）；取上清液，用BCA法測定蛋白濃度；加4x上樣緩沖液，沸水浴變性5min，快速冷卻，分裝，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

（b）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

配制分離膠。將分離膠注入垂直放置的玻璃板縫隙中，頂層加入1cm高度的異丙醇覆蓋膠面。室溫靜置至凝膠與異丙醇之間有一水平的清晰界面，倒掉異丙醇，用濾紙凝膠頂部液體。CREB選用10%的分離膠，BDNF均選用12%的分離膠。

配制濃縮膠。將配好的濃縮膠注入玻璃板問隙。立即插入齒梳，室溫靜置30 min左右。

電泳。將凝膠插入垂直電泳槽中，小心拔出梳子，加滿電泳緩沖液，往梳孔中加入蛋白分子量marker（3μl/孔）和樣品（8μl/孔）；電壓80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后,將電壓增至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)接近分離膠底部。關(guān)閉電源，取下凝膠，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

（c）轉(zhuǎn)膜

按照凝膠大小，剪PVDF膜和兩張Bio-RAD專用濾紙，將剪好的濾紙，海綿墊和夾子在電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20min。PVDF膜用甲醇浸泡5min：在轉(zhuǎn)膜夾中，從負(fù)極（黑色）到正極（白色）依次排放：海綿墊—濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙—海綿墊，蓋好正極板，插入電轉(zhuǎn)移槽，倒入電轉(zhuǎn)移液，蓋上蓋；冰浴電轉(zhuǎn)，350mA, 1h。

（d）封閉及抗原抗體反應(yīng)

封閉。電轉(zhuǎn)完畢后，將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST中，室溫輕搖1h。

孵育一抗。將PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀釋液，將膜完全覆蓋，趕出氣泡，4℃過夜。一抗雜交后用10%TBST洗10 min，每次溫振搖，共3次。

孵育二抗。洗滌后，將PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀釋液，將膜完全覆蓋，趕出氣泡，室溫孵育1h。二抗雜交后用10%TBST洗滌10 min，每次室溫振搖，共３次。

（e）顯色

將A液和B液按1：1比例混勻配制化學(xué)發(fā)光液，避光保存；將膜放于剪好的自封袋中，均勻滴加發(fā)光液，暗處放置3min；置于凝膠電泳顯色儀中照相。

3 評價(jià)結(jié)果

（1）行為學(xué)結(jié)果

①獎(jiǎng)勵(lì)性條件反射實(shí)驗(yàn)

造模14天后從第1天起，與正常組相比，尾吊組鼻觸次數(shù)減少（P＜0.05），尾平組在第2天與正常組形成差異（P＜0.01），尾平組與尾吊組在第3天差異出現(xiàn)顯著性（P＜0.01）；28天時(shí)，與正常組和尾平組相比，尾吊組的鼻觸次數(shù)顯著性的減少（P＜0.01），尾平組與正常組間無差異。

圖4 模擬失重對大鼠獎(jiǎng)勵(lì)性條射鼻觸次數(shù)的影響

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與尾平組比較$P＜0.05，$$P＜0.01。

②水迷宮實(shí)驗(yàn)

對逃避潛伏期的影響：14天時(shí)，與正常組和尾平組相比，尾吊組的逃避潛伏期明顯增加，從第2天開始出現(xiàn)差異（P＜0.01），尾吊組與正常組無差異；28天時(shí)，尾吊組與正常組和尾平組相比，逃避潛伏期顯著增加，從檢測第1天起，尾吊組與正常組和尾平組一直形成顯著性差異（P＜0.01），形成較穩(wěn)定的顯著性差異，尾平組與正常組無差異。

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尾平組比較，$P＜0.05，$$P＜0.01。

對總游程的影響：14天時(shí)，尾吊組與正常組相比，總游程有明顯的增加，從第3天起差異形成顯著性（P＜0.01），與尾平組相比，從第3天開始出現(xiàn)差異（P＜0.05）并與第4、5天差異形成顯著性（P＜0.01），尾平組與正常組無差異；28天時(shí)，尾吊組與正常組和尾平組相比，總游程顯著增加，從第3天起差異出現(xiàn)顯著性（P＜0.01），并形成較穩(wěn)定的差異，尾平組與正常組無差異。

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尾平組比較，$P＜0.05，$$P＜0.01。

同時(shí)，采用穿梭實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，尾吊動(dòng)物的聯(lián)想學(xué)習(xí)記憶能力降低（14天造模后），表現(xiàn)在主動(dòng)穿梭次數(shù)、安全區(qū)時(shí)間等指標(biāo)上。

（2）分子生物學(xué)檢測

①HPA軸相關(guān)指標(biāo)檢測

與正常組相比，尾吊顯著性地增加了血清中皮質(zhì)酮和ACTH的含量（P＜0.01），可引起下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（HPA軸）功能亢進(jìn)。

注：與正常組比較，**P＜0.01。

② 蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn),與正常組相比，尾吊組CREB和BDNF的表達(dá)量顯著減少（P＜0.01）。

1模擬失重實(shí)時(shí)監(jiān)控裝置的建立

裝置由多個(gè)箱體單元組成，每一個(gè)箱體單元包括至少一個(gè)尾吊籠，尾吊籠設(shè)置在箱體單元內(nèi)，用于提供動(dòng)物尾部懸吊實(shí)驗(yàn)的空間；每一個(gè)箱體單元的上方安裝有攝像裝置，用于獲取箱體單元中動(dòng)物模擬失重尾部懸吊實(shí)驗(yàn)時(shí)的長期、動(dòng)態(tài)、連續(xù)、實(shí)時(shí)的自發(fā)活動(dòng)圖像信息；每一個(gè)尾吊籠的上方安裝有懸吊裝置，用于與動(dòng)物尾部連接；每一個(gè)尾吊籠上方安裝有脫落檢測裝置，用于在動(dòng)物尾部懸吊實(shí)驗(yàn)時(shí)，檢測動(dòng)物尾部懸吊是否脫落，且在檢測到動(dòng)物尾部脫落時(shí)，向計(jì)算機(jī)系統(tǒng)發(fā)出報(bào)警信號(hào)；以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，用于接收攝像裝置發(fā)送的圖像信息和所述脫落檢測裝置發(fā)送的報(bào)警信號(hào)，并將報(bào)警信號(hào)發(fā)送給指定的實(shí)驗(yàn)人員。

與以往尾吊籠相比，此次的模擬失重裝置具有以下特點(diǎn)：

（1）箱體單元包括至少一個(gè)尾吊籠，實(shí)現(xiàn)一個(gè)攝像裝置同步對箱體單元中的至少一個(gè)尾吊籠中的動(dòng)物的自主活動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控及圖像提取，而且還可在攝像裝置的鏡頭之前設(shè)置紅外透鏡，通過該紅外透鏡濾除其他光線的干擾，提高圖像的信噪比。

（2）可通過脫落檢測裝置檢測動(dòng)物尾部懸吊是否脫落，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)將報(bào)警信號(hào)發(fā)送給指定的實(shí)驗(yàn)人員，實(shí)現(xiàn)脫落報(bào)警，使得實(shí)驗(yàn)人員可及時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。

（3）通過在尾吊籠外側(cè)面設(shè)置雙瓶飲水裝置，可為動(dòng)物的糖水偏愛實(shí)驗(yàn)檢測提供條件，實(shí)現(xiàn)對抑郁或類抑郁行為的檢測。

（4）箱體單元中的尾吊籠之間可設(shè)置活動(dòng)隔板層，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的交流受阻隔離狀態(tài)和非隔離狀態(tài)的互換。

總而言之，本裝置的建立充分考慮到了動(dòng)物模型多樣本量、時(shí)間長、人工觀察工作量大，脫落預(yù)處理不及時(shí)等因素，可實(shí)現(xiàn)對尾部懸吊的動(dòng)物的自主活動(dòng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測、脫落報(bào)警以及為抑郁或類抑郁行為檢測提供條件。同時(shí)提供了路程、速度、時(shí)間三個(gè)指標(biāo)，運(yùn)動(dòng)與靜息兩種狀態(tài)的分時(shí)、分段、分區(qū)等數(shù)據(jù)，以及動(dòng)物的尾部懸吊的狀態(tài)等信息，能實(shí)時(shí)獲取、保存和輸出動(dòng)物的實(shí)時(shí)活動(dòng)圖像，從而確保了實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性、可靠性。

注：11：箱體單元；12：尾吊籠；13：攝像裝置；14：脫落檢測裝置；15：食物盒；16：雙瓶飲水裝置；17：發(fā)光二極管；18：活動(dòng)隔板層；19：柵網(wǎng)；20：廢物收集盒；21：多路圖像卡；22：實(shí)驗(yàn)軟件；23：接口卡；24：傳輸接口；31：脫落檢測單元；32：消息收發(fā)單元。

2模型的誘導(dǎo)方法

（1）動(dòng)物：SPF級，Wistar大鼠、SD大鼠（200±10 g），雄性

（2）材料：醫(yī)用橡皮膏、帆布手套、傷濕止痛膏

（3）儀器：動(dòng)物模擬失重尾部懸吊實(shí)時(shí)監(jiān)測裝置(均由北京鑫海華儀公司、中國航天員科研訓(xùn)練中心和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所聯(lián)合研制)

（4）誘導(dǎo)過程：大鼠尾吊采用動(dòng)物模擬失重尾部懸吊實(shí)時(shí)監(jiān)測裝置進(jìn)行，每個(gè)箱體尺寸為26㎝×26㎝×30㎝。尾吊方法簡述如下：使大鼠鉆入帆布手套，僅使其尾部外露。將傷濕止痛膏剪成約長7cm，寬約1cm的長條狀，將其中間段1/3長度延長軸方向?qū)ΟB，兩頭端1/3處粘在大鼠距尾根部約1cm處，使其成一個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)，將醫(yī)用橡皮膏螺旋形包裹在其外部，避免滑脫。將一頭帶鉤的金屬鏈條鉤住環(huán)狀膏藥，另一頭穿過尾吊儀微動(dòng)開關(guān)的環(huán)形掛圈，根據(jù)需要調(diào)節(jié)鏈條長度，并用金屬夾將鏈條固定，使動(dòng)物軀干與尾吊籠底部約成-30°角，使大鼠借助前肢可在尾吊籠內(nèi)360°自由活動(dòng)和自由飲食飲水。行為學(xué)檢測期間應(yīng)保持大鼠處于造模時(shí)的尾吊狀態(tài)，在行為學(xué)檢測時(shí)應(yīng)盡量減少動(dòng)物的非尾吊時(shí)間，取下后及時(shí)檢測，檢測完后及時(shí)恢復(fù)尾吊。

隨著我國在載人航天工程事業(yè)取得重大成功，空間站工程也正式啟動(dòng)。空間站工程要求航天員必須具備較長時(shí)間的連續(xù)在軌駐留能力，必須克服長時(shí)間航天飛行因受到失重、晝夜節(jié)律改變、狹小密閉環(huán)境等多種因素影響所導(dǎo)致的一系列諸如心血管功能障礙、失重骨丟失、肌肉萎縮、免疫功能下降等失重生理效應(yīng)。同時(shí)，航天環(huán)境可造成認(rèn)知功能及反應(yīng)判斷能力下降，直接影響航天員對信息處理可靠性，甚至造成重大操作失誤，對航天工作帶來的危害則難以估量［1-3］。

在受科學(xué)技術(shù)、經(jīng)費(fèi)等限制，航天飛行難以長期、重復(fù)進(jìn)行，地面模擬失重的實(shí)驗(yàn)方法的建立就顯得尤為重要。Darren M. Lipnicki 等分析了25例健康男性受試者在60天頭低位臥床前及臥床期間（第51天）LGT的行為表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)臥床前及期間受試者的決策能力明顯改變[4]。MesserottiBenvenuti 等將22 名男性受試者隨機(jī)分為對照組及頭低位臥床組，3小時(shí)后對受試者進(jìn)行圖片觀察任務(wù)測試，結(jié)果表明頭低位臥床會(huì)明顯影響了受試者的學(xué)習(xí)能力[5]。使用功能性磁共振fMRI方法測試結(jié)果表明失重狀態(tài)時(shí)，興奮腦區(qū)的激活范圍和強(qiáng)度有明顯的減少[6]。吳大蔚等觀察了尾部懸吊模擬微重力對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，發(fā)現(xiàn)尾吊7d及12d小鼠空間記憶能力降低[7]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在地面模擬失重的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。對于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，起初是采用全身或局部限動(dòng)的方法模擬失重狀態(tài)下的低活動(dòng)度，逐漸發(fā)展到采用頭低位的方法模擬失重環(huán)境下的血液頭向分布生理學(xué)效應(yīng)[8]。頭低位尾部懸吊模擬失重應(yīng)激程度較輕，可長時(shí)間模擬失重狀態(tài)。該模型的研究可為航天等特因環(huán)境下，學(xué)習(xí)記憶障礙機(jī)理研究、防護(hù)和藥物研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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