1 技術(shù)難點

（1）小鼠乳腺癌原位接種：在接種過程中難以把控是否接種在乳房墊而不是皮下，否則建模失敗。

（2）小鼠體內(nèi)血行轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞與血小板形成的復(fù)合物難以富集，導(dǎo)致觀察受礙。

2 創(chuàng)新性

（1）模擬腫瘤生長及轉(zhuǎn)移全過程，考慮腫瘤微環(huán)境對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的重要影響。

（2）模擬抗腫瘤轉(zhuǎn)移的常規(guī)治療方法，更直接的評價抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的藥效。

（3）檢測體內(nèi)腫瘤細胞-血小板聚集體，使檢測結(jié)果更加直觀、可靠。

（1）4T1乳腺原位腫瘤移植模型構(gòu)建

將Luc標(biāo)記的小鼠乳腺癌細胞4T1細胞經(jīng)皮下接種至BALB/C小鼠，用活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤面積顯著增大，小鼠可存活45天以上，能夠觀察到明顯的肺轉(zhuǎn)移及其它臟器的轉(zhuǎn)移。

（2）4T1腫瘤手術(shù)切除及術(shù)后轉(zhuǎn)移成像

在原位腫瘤手術(shù)摘除后當(dāng)天，小鼠熒光成像結(jié)果表明：（1）小鼠原位腫瘤的影像完全消失，證明原位腫瘤手術(shù)摘除完全，不存在原位腫瘤的殘留，從而避免了術(shù)后殘留對腫瘤轉(zhuǎn)移進展的干預(yù)和影響；（2）小鼠中均出現(xiàn)了數(shù)量較多、成像明確、以肺轉(zhuǎn)移為主的乳腺癌轉(zhuǎn)移的陽性影像，從而證明，我們構(gòu)建的乳腺癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型有效、可信。

（3）4T1血行轉(zhuǎn)移及T-P互作評價：

免疫熒光染色后可以觀察到明顯的血小板CD61（紅色）和MHCI類（黃色）呈陽性；流式細胞儀下CEA陽性表達者為循環(huán)腫瘤細胞，同時可共同表達血小板標(biāo)記物CD41a者則表明循環(huán)腫瘤細胞在體內(nèi)被血小板包覆；NK細胞在腫瘤細胞與血小板互作的條件下，其數(shù)量及殺傷活性低于正常血液NK細胞。

（1）4T1乳腺原位腫瘤移植模型構(gòu)建

將Luc標(biāo)記的小鼠乳腺癌細胞4T1細胞經(jīng)皮下接種至BALB/C小鼠，用活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤面積顯著增大，小鼠可存活45天以上，能夠觀察到明顯的肺轉(zhuǎn)移及其它臟器的轉(zhuǎn)移。

（2）4T1腫瘤手術(shù)切除及術(shù)后轉(zhuǎn)移成像

在原位腫瘤手術(shù)摘除后當(dāng)天，小鼠熒光成像結(jié)果表明：（1）小鼠原位腫瘤的影像完全消失，證明原位腫瘤手術(shù)摘除完全，不存在原位腫瘤的殘留，從而避免了術(shù)后殘留對腫瘤轉(zhuǎn)移進展的干預(yù)和影響；（2）小鼠中均出現(xiàn)了數(shù)量較多、成像明確、以肺轉(zhuǎn)移為主的乳腺癌轉(zhuǎn)移的陽性影像，從而證明，我們構(gòu)建的乳腺癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型有效、可信。

（3）4T1血行轉(zhuǎn)移及T-P互作評價：

免疫熒光染色后可以觀察到明顯的血小板CD61（紅色）和MHCI類（黃色）呈陽性；流式細胞儀下CEA陽性表達者為循環(huán)腫瘤細胞，同時可共同表達血小板標(biāo)記物CD41a者則表明循環(huán)腫瘤細胞在體內(nèi)被血小板包覆；NK細胞在腫瘤細胞與血小板互作的條件下，其數(shù)量及殺傷活性低于正常血液NK細胞。

2.1 小鼠乳腺癌原位腫瘤模型建立及術(shù)后干預(yù)

對小鼠高侵襲力乳腺癌進行體外培養(yǎng)和擴增，并將細胞狀態(tài)和增殖水平調(diào)整至最佳水平。在此基礎(chǔ)上，收獲腫瘤細胞，并對細胞進行準確計數(shù)，按照1*104/100ul的細胞濃度將細胞在無菌生理鹽水中稀釋成單細胞懸液，置于冰上備用。

在小鼠的準備上，本實驗選用在SPF級飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)的Bab/c小鼠，雌性、周齡6—8周。在接種腫瘤正式實驗前，小鼠進行了3天的適應(yīng)性飼養(yǎng)，并在腫瘤接種前一天進行腹部去毛備皮，充分暴露小鼠第四對脂肪墊的皮膚，利于腫瘤接種。

在腫瘤接種時，將備好的細胞懸液接種于小鼠乳房的第四對脂肪墊中，并在接種時注意接種部位和接種深度的選擇。針頭不能穿過脂肪墊進入腹腔中，也不能插入過淺，接種于皮下，同時還需注意進針位置和角度，防止腫瘤溶液溢出，從而影響腫瘤接種的數(shù)量差異。

在小鼠準確接種腫瘤細胞后，對小鼠持續(xù)飼養(yǎng)5-7天，待原位腫瘤明確形成并得到初步增殖擴大后，開始對各組小鼠進行隨機分組給藥。給藥途徑選取為腹腔注射給藥，給藥體積為200ul，各給藥組設(shè)定為藥物溶劑注射陰性對照組（NC）、0.1mg/kg（ESC-L）和1mg/kg（ESC-H）組。每日給藥一次，并定期觀測記錄小鼠體重、原位腫瘤的生長狀態(tài)和瘤體積。

在小鼠日常給藥30—40天后，當(dāng)原位腫瘤的瘤體積生長達到相應(yīng)水平后，將小鼠的原位腫瘤進行切除。手術(shù)時，選用戊巴比妥（40mg/kg）注射和異氟烷吸入混合麻醉，從而保證了麻醉深度和麻醉安全性。在手術(shù)移除原位腫瘤時，需注意將原位腫瘤盡可能切除干凈，從而有效避免腫瘤復(fù)發(fā)和原發(fā)部位腫瘤對后續(xù)轉(zhuǎn)移進程的實驗干擾。在原位腫瘤術(shù)后，在飼養(yǎng)水中加入慶大霉素，并對術(shù)后小鼠每日進行腹腔局部消毒。以保證小鼠順利度過手術(shù)感染期。

在小鼠術(shù)后感染期度過后（約3-5天），繼續(xù)對小鼠開始藥物干預(yù)。并于藥物干預(yù)持續(xù)20天后，作為實驗終點。處死小鼠，獲得各重要器官臟器，檢測其病理性變化，并著重對乳腺癌主要轉(zhuǎn)移靶器官（骨、肝、腦、肺）的轉(zhuǎn)移水平進行評價和拍照，并保存標(biāo)本，用于后續(xù)的組織、細胞和分子水平檢測。

圖1 乳腺癌轉(zhuǎn)移體內(nèi)藥效學(xué)評價平臺及基本實驗流程簡介。上圖：荷瘤小鼠體內(nèi)成像實驗的基本流程示意圖。下圖：小鼠原味腫瘤接種的位置示意圖及分組情況說明。

圖2 4T1-LUC小鼠原位腫瘤生長的活性動態(tài)檢測。圖中分別展示了小鼠隨機分組給藥第一天(A)、第五天(B)、第十天(C)、第二十天(D)和第二十五天(E)的原位腫瘤成像結(jié)果。

圖3.4T1-LUC荷瘤小鼠轉(zhuǎn)移進程的活性。圖中分別顯示了原位腫瘤切除當(dāng)天(A)、術(shù)后持續(xù)化療10天(B)和20天(C)的小動物成像結(jié)果。

2.2 T-P體內(nèi)復(fù)合物及NK細胞檢測

抽取小鼠外周血，對血小板糖蛋白IIIa(CD61)和MHCI類進行熒光染色，觀察其熒光染色情況以確定腫瘤細胞與血小板之間存在相互作用；應(yīng)用流式細胞儀分析CEA及血小板標(biāo)記物CD41a，以確定循環(huán)腫瘤細胞在體內(nèi)被血小板包覆；應(yīng)用流式細胞儀檢測外周血NK細胞標(biāo)記物CD56以確定其數(shù)量；應(yīng)用LDH法及WST-8試劑盒驗證NK細胞殺傷活性。

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的關(guān)鍵特征之一，其發(fā)生不可避免及轉(zhuǎn)移灶難以治愈的特點是導(dǎo)致90%以上癌癥患者死亡的主要原因[1]?，F(xiàn)有治療方法主要采用手術(shù)切除、化療和放療，但均存在著毒副作用強、易復(fù)發(fā)等局限性[2]。且在實驗研究中，目前的動物實驗模型無法有效真實模擬腫瘤轉(zhuǎn)移及臨床治療過程，故亟需一特異性模擬腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、定植全鏈條，符合當(dāng)前抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物治療基本流程規(guī)范的動物模型，更直接、可信的評價抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物治療效果。

1. 腫瘤與微環(huán)境二元整合互作是腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控的功能單元和機制基礎(chǔ)。

早在1889，英國醫(yī)生Stephen Paget針對轉(zhuǎn)移過程提出了“種子-土壤”假說，把惡性腫瘤比作種子，通過血液循環(huán)或淋巴道轉(zhuǎn)移到遠端，尋找到適合其生長的環(huán)境，即所謂的“土壤”，形成轉(zhuǎn)移灶，進而發(fā)展為繼發(fā)性腫瘤[3]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移前的腫瘤“土壤”因素可以通過增強“種子”的轉(zhuǎn)移特性及侵襲能力等，促進轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4]。而這種由腫瘤細胞和“土壤”中多種間質(zhì)細胞、細胞因子、趨化因子等相互作用后形成的利于腫瘤生存的特殊環(huán)境，稱為腫瘤微環(huán)境（tumormicroenvironment, TME）。TME主要由成纖維細胞和肌成纖維細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞、免疫和炎癥細胞、血管和淋巴管系統(tǒng)以及細胞外基質(zhì)組成，在轉(zhuǎn)移發(fā)生時中各司其職、相互影響，直接或間接促進轉(zhuǎn)移進程[5]。例如，腫瘤內(nèi)的血管系統(tǒng)表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)和功能特性的改變，導(dǎo)致缺氧和營養(yǎng)供應(yīng)有限，從而改變腫瘤細胞的基因表達，提高細胞的存活和對凋亡誘導(dǎo)的抵抗[6]。TME在轉(zhuǎn)移研究中受到越來越廣泛地關(guān)注，其不僅在轉(zhuǎn)移全過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，更影響著臨床治療效果，在抗腫瘤轉(zhuǎn)移中不可忽視，可作為一具強吸引力的治療靶向，降低腫瘤耐藥性及復(fù)發(fā)風(fēng)險。

1.2乳腺癌腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)是腫瘤治療的未來的重點領(lǐng)域和關(guān)鍵靶點。

乳腺癌（breastcancer, BC）是女性最常見的癌癥，也是全世界女性癌癥患者死亡的主要病癥，其高轉(zhuǎn)移性、高侵襲性、高復(fù)發(fā)率的特性對廣大女性健康和生命安全造成極大威脅[7]。隨著治療觀點及方法的不斷進步，諸多研究認為，乳腺癌的發(fā)生并非乳腺腫瘤細胞單方面的作用，而是乳腺癌與其所處的TME相互作用引起的[7]。

在分析TME與乳腺癌細胞互作對轉(zhuǎn)移的影響中，研究人員多聚焦于脂肪細胞、成纖維細胞以及免疫炎癥細胞三個方面：（1）腫瘤相關(guān)脂肪細胞是乳腺組織中占比最大的細胞，表現(xiàn)為惡性表型，其脂質(zhì)含量及晚期脂肪細胞分化標(biāo)志物減少，并過表達炎癥因子與蛋白酶，通過釋放多種脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素、白細胞介素、趨化因子配體2等，促進BC的增殖、血管生成、擴散、侵襲和轉(zhuǎn)移；（2）腫瘤相關(guān)成纖維細胞是TME中最大的基質(zhì)細胞群，其可通過影響雌二醇水平，分泌多種因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo-proteinase, MMPs），誘導(dǎo)干細胞、表觀遺傳改變等促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，還可通過增加MMP14的表達和MMP9的活性，誘導(dǎo)原位癌上皮細胞在體內(nèi)外的侵襲能力[8]。（3）腫瘤相關(guān)免疫炎癥細胞會阻礙藥物進入腫瘤細胞內(nèi)發(fā)揮藥效，例如巨噬細胞可重塑基質(zhì)，產(chǎn)生的MMPs、半胱氨酸組織蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，允許細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）破壞以及隨后的腫瘤細胞侵入周圍組織，從而引導(dǎo)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[9]。

目前的治療方法除集中于提高對腫瘤細胞的殺傷能力，也逐漸的靶向TME中的基質(zhì)細胞。TME作為乳腺癌細胞賴以生存的“土壤”，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，且基質(zhì)細胞的基因組穩(wěn)定性使其成為新型抗癌治療劑的理想靶標(biāo)，發(fā)生治療耐藥性的風(fēng)險降低，使得TME基質(zhì)細胞靶向治療成為未來有潛力的抗乳腺癌治療方法。

1.3乳腺癌微環(huán)境包括原位腫瘤微環(huán)境與血液微環(huán)境兩部分，是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要決定要素，也是中藥抗腫瘤轉(zhuǎn)移有效性評價和科學(xué)性闡釋的核心領(lǐng)域。

1.3.1乳腺癌原位腫瘤的特征性描述

在乳腺原位癌TME中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAM)是最豐富的免疫細胞群，可促進腫瘤發(fā)生、新血管生成、免疫抑制TME重塑、癌癥化療抵抗、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。TAMs可分為M1型和M2型，M1型TAMs通過表達趨化因子CCL20、趨化因子生長調(diào)節(jié)基因(C－X－C motif ligand，CXCL)10和CXCL11以及分泌干擾素和白細胞介素12募集、激活自然殺傷細胞和樹突狀細胞；此外，M1型TAMs通過分泌趨化因子CCL15等誘導(dǎo)激活 T 細胞，具有抗腫瘤作用。M2型TAMs表達趨化因子CCL17等能增加VEGF、IL－8、MMP、轉(zhuǎn)化生長因子和T細胞抑制分子的分泌，促進血管生成和細胞外基質(zhì)重塑信號的表達，具有致瘤作用[7]。

由此可見，在乳腺癌原位瘤中，靶向TAM并介導(dǎo)其表型表達，可以有效影響腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。已有研究發(fā)現(xiàn)顆粒前體蛋白聯(lián)合TAM衍生的外顯體能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移。為此，乳腺癌原位TME在治療乳腺癌轉(zhuǎn)移及評價藥物抗轉(zhuǎn)移療效實驗中不可或缺。

1.3.2乳腺癌血行轉(zhuǎn)移的特征性描述

腫瘤細胞通過血液循環(huán)向遠處擴散是乳腺癌患者轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要途徑，即血行轉(zhuǎn)移。原位癌細胞增殖過程中，腫瘤性血管生長，侵襲基底膜、穿入血管后在循環(huán)系統(tǒng)中存活，形成瘤栓并運行到靶器官，滯留于靶器官的微小血管中，然后穿出血管形成微小轉(zhuǎn)移灶。

癌細胞血行轉(zhuǎn)移成功的關(guān)鍵是其在血流中能否存活，因為大部分血流中癌細胞將被剪切力和免疫系統(tǒng)攻擊破壞，少于0.01%的癌細胞能夠轉(zhuǎn)移成功。目前的證據(jù)表明，在多種惡性腫瘤中都存在血小板數(shù)量增加和血小板活化現(xiàn)象，且這兩者變化與癌癥病情進展密切相關(guān)。腫瘤細胞自原發(fā)位置的脫落，誘導(dǎo)的血小板聚集在腫瘤細胞周圍，保護腫瘤細胞在循環(huán)中免于破壞、利于腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附及移出血管，保證腫瘤細胞在血管內(nèi)可以存活[10]。且腫瘤血行轉(zhuǎn)移在癌癥發(fā)生早期便已存在，因此及時、有效地發(fā)現(xiàn)和干預(yù)循環(huán)腫瘤細胞的產(chǎn)生、阻斷血行轉(zhuǎn)移是減少乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移、提高患者生存率和生存質(zhì)量的關(guān)鍵。但在動物實驗過程中，單純向靜脈注射的腫瘤細胞模擬腫瘤血行并不能等同于腫瘤轉(zhuǎn)移細胞，其存在的差別會造成實驗結(jié)果可信度存疑。在抗腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)動物模型中必須對此進行考慮。

1.3.3中醫(yī)藥調(diào)節(jié)乳腺癌腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境中細胞與分子不斷相互作用的現(xiàn)象，與中醫(yī)學(xué)“陰陽失衡”的理論存在共通之處：機體陰陽消長失去相對平衡，氣血、經(jīng)絡(luò)、臟腑等相互關(guān)系失調(diào)，則疾病發(fā)生發(fā)展。從中醫(yī)角度認識腫瘤微環(huán)境，并利用中醫(yī)藥多成分、多效應(yīng)的特點，干預(yù)調(diào)控乳腺癌腫瘤微環(huán)境，可為乳腺癌的治療提供新的思路。

臟腑虧虛、正氣不足為乳腺癌發(fā)病之本。從扶正固本入手，提高機體免疫功能、改善乳腺癌腫瘤微環(huán)境，可以發(fā)揮抗腫瘤作用。常用藥物如人參、白術(shù)、黃芪、靈 芝、黨參、當(dāng)歸、白芍、淫羊藿等。細胞實驗及動物實驗均表明，人參皂苷 Rg3 可誘導(dǎo)巨噬細胞向M1極化，改善腫瘤微環(huán)境[11]。黃芪多糖與巨噬細胞在一個體外培養(yǎng)體系中共存，能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。

此外，瘀血阻于乳絡(luò)發(fā)為乳腺癌，故活血化瘀是治療乳腺癌的法則之一。活血化瘀類中藥如丹參、郁金、姜黃、莪術(shù)、雞血藤、川芎、三七等均為治療乳腺癌的常用藥物，主要機制是對腫瘤細胞的抑制、減少骨髓來源的抑制性細胞數(shù)量、抗腫瘤血管生成等[7]。對此，有必要充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，從辨證論治的角度深入研究中醫(yī)藥在乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的作用機制，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療方法，提高其在實際治療中的應(yīng)用，使乳腺癌患者受益。

1.4 現(xiàn)有模型及不足

1.4.1現(xiàn)有原位腫瘤移植模型以皮下種植為主，以腋窩或腹股溝為主要部位，缺乏微環(huán)境特異性模擬，更缺乏臨床腫瘤治療原位手術(shù)結(jié)合術(shù)后化療的流程模擬。

1.4.2現(xiàn)有轉(zhuǎn)移路徑模型以尾靜脈單獨注射為主，雖能有效構(gòu)建腫瘤入血后的轉(zhuǎn)移活性評價，但僅限于對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移強度或位點的粗略分析，與腫瘤微環(huán)境組分的互作評價及腫瘤血液免疫微環(huán)境對循環(huán)系統(tǒng)腫瘤細胞的檢測模型和評價認為空白。本模型有效構(gòu)建，能夠為活血化瘀中藥基于腫瘤血液微環(huán)境調(diào)節(jié)實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移治療應(yīng)用的藥效評價和機理解析提供有效的模型支撐。

1.5總結(jié)

基于上述分析和目前相關(guān)技術(shù)研究體系的不足，本規(guī)范擬強調(diào)腫瘤與微環(huán)境之間存在相互作用關(guān)系，在腫瘤轉(zhuǎn)移中重視原位腫瘤細胞與巨噬細胞、循環(huán)腫瘤細胞與血小板對腫瘤轉(zhuǎn)移全過程產(chǎn)生的重要影響，全方位真實模擬腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及臨床抗腫瘤治療流程，提高抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的藥效評價可信度。

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