該項研究系統(tǒng)分析了新冠肺炎癥狀明顯期水貂病理改變和代謝紊亂的特征，建立了一個理想的新冠病毒感染重癥動物模型，模擬了新冠病毒引起的機體系統(tǒng)和嚴重的病理改變特征。

所有涉及的病毒實驗操作全部在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所 ABSL 3 實驗室完成，該實驗室已經(jīng)具備相關(guān)實驗室和福利倫理資質(zhì)。

構(gòu)建可以模擬臨床重型和危重型患者的動物模型，勾勒出新冠肺炎癥狀明顯期水貂模型肺組織和肺外多組織臟器時相性動態(tài)變化病理全景圖。與臨床重癥患者的報道一致，受感染的水貂病理損傷累及多個臟器，表現(xiàn)出多器官和系統(tǒng)的病變，伴有炎癥反應(yīng)顯著增加，病毒在肺臟（圖1）、心血管（圖2）、肝膽（圖3）、泌尿、內(nèi)分泌（圖4）、消化和免疫系統(tǒng)廣泛分布。更重要地，血清的脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析表明，水貂在感染后6dpi的變化與臨床重型和危重型COVID-19患者極為相似（圖5），且這種變化與其組織病理學(xué)改變息息相關(guān)。特別是代謝途徑改變，維生素、脂類、膽固醇、類固醇、氨基酸和蛋白質(zhì)的消化和吸收異常，肝功能障礙等，表明機體代謝和免疫失調(diào)。在感染后水貂血清中，升高的犬尿氨酸促進了犬尿氨酸代謝通路的顯著激活，并與巨噬細胞的激活有關(guān)，解釋了病毒與激活的巨噬細胞在全身多臟器共定位的現(xiàn)象。另外，我們篩選出數(shù)種重要的代謝產(chǎn)物具有作為疾病治療靶向分子和潛在生物標志物的可能（圖6）。

與對照組相比，感染后第一天（1dpi）水貂肺組織即表現(xiàn)出急性炎癥和間質(zhì)增寬，在疾病發(fā)展過程中，4到6dpi病理損傷最嚴重，主要表現(xiàn)為重度間質(zhì)性肺炎，肺泡間隔嚴重增寬，多個肺泡融合，肺泡上皮增生，肺泡腔內(nèi)有彌漫的滲出液和炎性細胞滲出物以及脫落變性壞死的上皮細胞。對1-6dpi的肺組織病毒RNA檢測時，每只動物都觀察到病毒RNA，14天時仍然有2/3動物肺組織檢測出少量病毒RNA。免疫組化檢測結(jié)果與之一致，4-6dpi時肺組織內(nèi)的病毒抗原最多。另外，4dpi時肺臟的滲出最為明顯，14dpi可以觀察到纖維結(jié)締組織增生（圖1）。

1試驗材料

1.1 病毒株

SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中國疾控中心譚文杰教授提供，新型冠狀病毒的全基因組序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan /IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)獲得，存放于中國微生物數(shù)據(jù)中心（登錄號NMDC10013001，基因組登錄號MDC60013002-01）。

1.2 試驗動物

選擇SPF 級6 周至 11月齡各段的ICR 與 C57 BL/ 6J，18-22 g，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所（IACUC 批準號：BLL20001）

2試驗操作規(guī)程

2.1 人 hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

表達人 hACE2 基因的小鼠，由小鼠ACE2 啟動子驅(qū)動，經(jīng) RT-PCR 和 Western blot 驗證 hACE2 基因在小鼠肺組織內(nèi)的表達（圖3）[4]。

2.2 病毒傳代

將新型冠狀病毒接種到Vero細胞進行分離和儲存。Vero細胞培養(yǎng)在DMEM（英濰捷基, 美國）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中，環(huán)境為37°C，5%CO2。新型冠狀病毒的病毒滴度用標準的半數(shù)細胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）進行分析。

2.3 動物模型的感染方法

（1） 途徑：滴鼻；

（2） 感染劑量：1× 105 TCID50 只；

（3） 感染體積：50 μl 只；

（4） 對照組：等體積 PBS。

2.4 動物模型分析

（1）癥狀觀察：感染后，每天觀察動物一般癥狀，記錄體重。

（2）病毒載量：定時收集各組動物臟器，進行RNA抽提，利用RT-PCR技術(shù)，檢測組織中病毒載量。RT-PCR所用的新型冠狀病毒引物如下：上游為5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游為5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分離：肺組織在 DMEM 溶液中研磨制備成勻漿，離心分離上清后，接種于Vero細胞分離病毒并觀察細胞病變。

（4）病理學(xué)觀察 用新鮮的組織制備冰凍切片，將組織固定在冷凍劑上，肺臟組織（10um）切好后在 100% 丙酮內(nèi)固定 15 分鐘，之后用 HE染色，鏡下觀察。

（5）免疫熒光染色肺臟切片用PBS洗三遍，用固定液充分固定，用封閉液室溫封閉 1h，一抗4°C 封閉過夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小時， PBS 洗三遍。用 DAPI 染細胞核觀察新型冠狀病毒在小鼠肺臟上的定位。新型冠狀病毒一抗為病人恢復(fù)期血清，羊源抗人二抗用， FITC 標記。

（6）感染后第14天，分離血清，測定特異性IgG。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方法

所有的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0 軟件分析，感染組小鼠和其他對照組小鼠用T 檢驗方法分析差異，顯著性差異用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

早在2020年4月，很多國家就發(fā)生了水貂養(yǎng)殖場內(nèi)新冠病毒可能由感染新冠的員工引入養(yǎng)殖場，傳給水貂的系列事件，經(jīng)濟損失慘重。病毒可在水貂之間傳播，在水貂間傳播的過程中發(fā)生突變，也可從水貂傳給養(yǎng)殖場的其他動物。水貂還可能將病毒傳播給水貂養(yǎng)殖場人員，以上數(shù)據(jù)都表明水貂對新冠病毒高度易感。構(gòu)建新冠肺炎水貂模型，系統(tǒng)地研究新冠病毒感染水貂后的致病機制和生理病理學(xué)改變，為闡述臨床病理機制，藥物和疫苗評價，生物標志物篩選提供良好的動物模型。