母子分離加早期離乳，雄性大鼠顯示焦慮行為，而雌性大鼠未顯示焦慮行為。在非應(yīng)激狀態(tài)下（ Y迷宮實(shí)驗(yàn)），雌性大鼠空間工作記憶能力下降。在應(yīng)激狀態(tài)下（Barnes迷宮實(shí)驗(yàn)），雌性和雄性大鼠的空間參考記憶能力均未受損。條件恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雄性大鼠環(huán)境相關(guān)的恐懼記憶能力增強(qiáng)。電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雄性大鼠前額皮層谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性下降，可能是其焦慮行為的產(chǎn)生機(jī)制之一。母子分離加早期離乳對成年大鼠影響的性別差異，還需要進(jìn)一步研究。

該研究在已報(bào)導(dǎo)的小鼠母子分離加早期離乳應(yīng)激方法基礎(chǔ)上，首次制備了大鼠母子分離加早期離乳應(yīng)激模型，注重了應(yīng)激因素的累計(jì)效應(yīng)，更接近臨床。本模型對于揭示早期生活應(yīng)激事件和成年后神經(jīng)精神障礙的關(guān)系及分子機(jī)制研究具有一定意義。本模型的其他病理生理機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

本模型不涉及除遺傳物質(zhì)重組對環(huán)境生態(tài)影響以外的其它安全性問題，本模型小鼠的保存、使用和處理均按照研究所倫理和安全委員會的要求執(zhí)行，可以確保不產(chǎn)生安全性問題。

1.MSEW雄性大鼠出現(xiàn)焦慮行為?？請鰧?shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是用于評價(jià)大小鼠焦慮行為的實(shí)驗(yàn)方法。空場實(shí)驗(yàn)中，動物在中央?yún)^(qū)時間減少或高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，動物在開臂時間和中央?yún)^(qū)時間減少，閉臂時間增多，均提示動物焦慮行為增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖1），雄性大鼠MSEW模型中央?yún)^(qū)時間減少。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖2），雄性大鼠MSEW模型開臂百分比，向下探頭次數(shù)均減少。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示雄性大鼠MSEW模型，而雌性大鼠無上述表現(xiàn)。

圖1 MSEW大鼠模型空場實(shí)驗(yàn)中央?yún)^(qū)時間（A）及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)開臂時間百分率（OT%）向下探頭次數(shù)（B）、中央?yún)^(qū)時間（C）及在閉臂中的時間（D）

2.MSEW雌雄性大鼠聯(lián)想學(xué)習(xí)無損傷，但MSEW雄性大鼠環(huán)境相關(guān)的恐懼記憶增強(qiáng)。條件性恐懼實(shí)驗(yàn)是由一個條件刺激（聲音、光照）與一個引起強(qiáng)烈恐懼反應(yīng)的非條件刺激（足底電擊）結(jié)合而成，當(dāng)條件刺激與非條件刺激產(chǎn)生聯(lián)想，生成條件性恐懼記憶，動物表現(xiàn)為僵直時間增長。本實(shí)驗(yàn)中，動物在條件恐懼訓(xùn)練箱中適應(yīng)3 min，對動物進(jìn)行5個循環(huán)的訓(xùn)練，每輪訓(xùn)練包括：接受聲音刺激（30s，5000HZ，70dB），聲音刺激的最后1 s給予電流刺激（0.65 mA ,1s）。每輪訓(xùn)練間隔30 s。24 h后，將動物放入同一訓(xùn)練箱。無聲音刺激，無電擊，記錄5 min 內(nèi)的木僵行為（freezing ），檢測環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼記憶。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，訓(xùn)練階段，MSEW雌雄性大鼠聯(lián)想學(xué)習(xí)無損傷。環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼記憶測試中，MSEW雄性大鼠恐懼記憶增強(qiáng)。

圖2MSEW大鼠模型條件性恐懼訓(xùn)練階段不動時間（A）及環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼實(shí)驗(yàn)不動時間（D）

3. MSEW雌性大鼠顯示空間工作記憶能力輕微下降。Y迷宮空間識別實(shí)驗(yàn)可用于空間工作記憶測試。訓(xùn)練期，關(guān)閉一個臂，讓大鼠在其他兩個臂自由探索5min. 15min間隔后進(jìn)入測試期，打開之前關(guān)閉的臂（新臂），大鼠在三個臂自由活動5min，記錄大鼠在各個臂探索的時間和路程，空間工作記憶損害的動物在新臂中探索的時間和路程會縮短。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雌性大鼠在測試期第一分鐘內(nèi)探索新臂時間雖增多，但與其他臂比較，無顯著性差異。雄性大鼠探索新臂時間增多，與其他臂比較，有顯著性差異。

圖3雌雄MSEW大鼠模型在Y迷宮實(shí)驗(yàn)測試期第一分鐘內(nèi)探索各臂時間的時間（A,B）

4. MSEW雌雄大鼠空間參考記憶無損傷。Barnes迷宮實(shí)驗(yàn)可用于檢測動物的空間參考記憶能力。Barnes迷宮尺寸為直徑120cm的白色啞光圓盤，上有12個直徑10cm圓洞，等距分布在圓盤邊緣，逃避盒固定在某一目標(biāo)洞下。實(shí)驗(yàn)時伴有強(qiáng)光（白熾燈，250 lux）和噪音刺激（吹風(fēng)機(jī)，80 db）。在Barnes圓盤周圍放置圓形、方形等空間參照物。適應(yīng)階段：將實(shí)驗(yàn)鼠放于逃避盒中適應(yīng)2 min。訓(xùn)練階段：將動物放于巴恩斯迷宮平臺中央的起始盒中，5ｓ后移走起始盒，打開實(shí)驗(yàn)平臺上的光源和吹風(fēng)機(jī)，實(shí)驗(yàn)動物以隨機(jī)方向開始探索迷宮，若動物成功進(jìn)入躲避盒，關(guān)掉吹風(fēng)機(jī)，使其躲避盒中適應(yīng)30 s（蓋上蓋子），若實(shí)驗(yàn)鼠在4 ｍｉｎ內(nèi)未進(jìn)入躲避盒，則由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)進(jìn)入，并令其在躲避盒中適應(yīng)30 s。每次實(shí)驗(yàn)間隔用７５％酒精擦拭迷宮表面和躲避盒并轉(zhuǎn)動迷宮，消除上次實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)鼠遺留的氣味和排泄物線索，確保實(shí)驗(yàn)鼠通過自身空間記憶線索找到目標(biāo)洞。目標(biāo)洞始終固定于同一方位，每天訓(xùn)練3次，每次4 min，訓(xùn)練2d。從第二次訓(xùn)練開始，每次訓(xùn)練之前將迷宮隨機(jī)轉(zhuǎn)動一至數(shù)個洞的位置，但目標(biāo)箱始終固定在同一方位?？臻g探索階段：訓(xùn)練結(jié)束后24 h，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。移除目標(biāo)洞，實(shí)驗(yàn)動物自由探索迷宮90s，測試其空間記憶能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雌雄大鼠MSEW模型對Barnes迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期和探索期尋洞潛伏期與對照組相比，均無顯著性差異。

圖4雌雄MSEW大鼠模型在Barnes迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期（A,B）尋洞潛伏期及探索期尋洞潛伏期及在目標(biāo)洞周圍的時間（C,D）

5. MSEW 雌雄大鼠前額皮層谷氨酸能神經(jīng)元電生理變化。MSEW 雌雄大鼠前額皮層神經(jīng)元的閾值和幅度沒有影響。在400和500pA刺激下，MSEW雄性大鼠谷氨酸能神經(jīng)元動作電位數(shù)目減少，提示神經(jīng)元興奮性下降。

圖5雌雄MSEW大鼠模型前額皮層谷氨酸能神經(jīng)元閾值和幅度（A,B）及400和500pA刺激下，產(chǎn)生的動作電位數(shù)目（C,D）

1. 實(shí)驗(yàn)動物及分組：SD孕鼠。實(shí)驗(yàn)分為雌性對照，雌性MSEW組，雄性對照，雄性MSEW組。

2. 實(shí)驗(yàn)儀器：曠場實(shí)驗(yàn)箱、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)箱、條件性恐懼測試分析系統(tǒng)

3. 實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程：

大鼠幼崽出生第二天至第五天(postnatal day，PND2-5天)，從母鼠家籠移出，放置在另外房間的母子分離實(shí)驗(yàn)箱，4h/d, 實(shí)驗(yàn)箱分隔成開放獨(dú)立的小隔間，每個隔間內(nèi)放置一只幼崽。實(shí)驗(yàn)箱放在加熱墊上，溫度維持在32℃左右。PND 6-16天, 母子分離8 h/d，母子分離實(shí)驗(yàn)在光照期進(jìn)行，固定在8:00-18:00時間段。PND17天,大鼠幼崽離乳，雌雄分籠。正常對照組幼崽始終在母鼠家籠，至PND 21天離乳，正常換水，換料，其余不予干擾。PND 6O天，進(jìn)行空場實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、新物體識別實(shí)驗(yàn)、Y迷宮實(shí)驗(yàn)及Barnes 迷宮實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每組取3只動物，麻醉，取腦，進(jìn)行前額皮層神經(jīng)電生理檢測。

生命早期（胚胎、新生兒、幼年）是機(jī)體腦發(fā)育的關(guān)鍵時期，對應(yīng)激的敏感性極高。該時期的應(yīng)激因素（如喪親、長期與父母分離以及兒童期受虐或忽視），可破壞腦的結(jié)構(gòu)和功能的形成，對機(jī)體產(chǎn)生長期甚至是終生的影響，其中對情緒和認(rèn)知功能的影響最大，是青少年及成年神經(jīng)精神疾患的高風(fēng)險(xiǎn)因素之一。

大鼠對環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)更為敏感，本研究建立了大鼠母子分離加早期離乳（Maternal separation with early weaning, MSEW）應(yīng)激模型，用于模擬生命早期應(yīng)激事件。這種雙重應(yīng)激模型更好的模擬了人類累計(jì)的應(yīng)激效應(yīng)（“cumulative”stress）導(dǎo)致青少年和（或）成年發(fā)生神經(jīng)精神疾患的現(xiàn)象。本研究觀察了MSEW模型雌雄大鼠成年的行為學(xué)表型和神經(jīng)電生理變化。