6歲以下的兒童處于“免疫功能不全期”，自身免疫系統(tǒng)發(fā)育還未成熟，免疫系統(tǒng)較易受到攻擊。在一些疾病的急性期，兒童常發(fā)生免疫細胞紊亂，而引起繼發(fā)感染。有研究表明，到2025年，中國將進入重度老齡化社會。隨著年齡的增長，人體免疫系統(tǒng)功能將逐漸衰退。免疫功能不足對老年人的健康產生極為不利的影響。目前，許多老年病需要長期用藥，部分藥物會產生免疫系統(tǒng)損傷的毒副作用，老年人在應用這類藥物后，相較成年人，對損傷會更敏感且恢復更緩慢。

本實驗以環(huán)磷酰胺為陽性藥物，可為日后評價對兒童、老人免疫系統(tǒng)有損傷作用的藥物提供基礎數據。我們亦對比了幼年、成年、老年鼠外周血、胸腺、脾臟免疫細胞的相關參數以及應用免疫抑制劑造模后的參數變化，為兒童、老人應用對免疫系統(tǒng)有調節(jié)作用的藥物時提供參考。

在制備模型使用環(huán)磷酰胺，應注意戴手套和口罩。剩余藥品及污染器械要注意安全處理。

1環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠白細胞及分類的影響

為研究不同年齡小鼠免疫損傷的發(fā)生和恢復的差異，我們首先比較了環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠白細胞數（109/L）、中性粒細胞比例、淋巴細胞比例的影響。未給藥時，幼年鼠白細胞數、中性粒細胞比例、淋巴細胞比例與成年鼠相近；老年鼠白細胞數、中性粒細胞比例顯著高于成年鼠，淋巴細胞比例顯著低于成年鼠，見表1（由于歷次測定成年鼠、老年鼠空白對照組數據無顯著差異（P＞0.05），故成年鼠老年鼠空白對照組數據均合并處理，下同）。

表1 不同年齡小鼠白細胞及分類

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注： 1）N_{幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12；}

給藥后，對比WBC結果發(fā)現，成年鼠白細胞數在第3天降到52%（為了更好地反映不同年齡小鼠損傷及恢復的規(guī)律，設各年齡小鼠空白對照數據為100%，以給藥組測定值/空白對照組測定值×100%作圖，下同），至第7天即可恢復正常水平。幼年鼠變化趨勢與成年鼠相似。老年鼠白細胞數在第3天降到27%，下降幅度遠大于成年鼠，且4周后只能恢復至42%，見圖1-A。

對比中性粒細胞比例發(fā)現，成年鼠中性粒細胞比例在第7天升高到130%，2周后可恢復至正常水平。幼年鼠中性粒細胞比例在第7天升高到221%，升高幅度大于成年鼠，2周后亦可恢復至正常水平。老年鼠中性粒細胞比例在第7天下降到59%，趨勢與成年鼠相反，4周后未能恢復到正常水平，見圖1-B。

對比淋巴細胞比例發(fā)現，成年鼠淋巴細胞比例在第7天小幅下降，下降到85%，2周后可恢復到正常水平。幼年鼠變化趨勢與成年鼠相似。老年鼠淋巴細胞比例在給藥后第3天即上升到119%，至第7天基本維持該水平，2周后可恢復到正常水平，見圖1-C。

2環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠器官指數的影響

在分析白細胞及分類的基礎上，我們進一步觀察了環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠免疫器官指數的影響。未給藥時，幼年鼠胸腺指數顯著高于成年鼠；脾臟指數與成年鼠無明顯差異。老年鼠胸腺指數顯著低于成年鼠；脾臟指數與成年鼠無明顯差異，見表2。

表2不同年齡小鼠器官指數

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注：1）N幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12

對比胸腺指數發(fā)現：成年鼠胸腺指數在給藥后第3天下降至58%，至第28天，只能恢復至77%。幼年鼠損傷及恢復情況與成年鼠相似。老年鼠胸腺指數在給藥后第3天未有明顯變化，第7天下降至55%，降至最低值時間晚于成年鼠，第14天后可恢復至正常值，見圖2-A。

對比脾臟指數發(fā)現：成年鼠脾臟指數在第3天下降至73%，第7天略有升高，第14天后可恢復至正常值。幼年鼠在第7天下降至68%，降至最低值時間晚于成年鼠，恢復情況與成年鼠相似。老年鼠在第3天下降至40%，下降程度高于成年鼠，至第7天，基本維持損傷水平，恢復情況與成年鼠相似，見圖2-B。

圖2環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠器官指數的影響

A:胸腺指數；B:脾臟指數

注：N=5；與同時間成年鼠相比，*P＜0.05

3 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠胸腺淋巴細胞分型的影響

在分析免疫器官指數的基礎上，我們進一步觀察了環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠胸腺淋巴細胞分型的影響。未給藥時，幼年鼠CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD8+T細胞比例均與成年鼠接近。老年鼠CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD8+T細胞比例均顯著低于成年鼠，見表3。

表3 不同年齡小鼠胸腺淋巴細胞分型檢測

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注：1）N_{幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12}

給藥后，對比CD4+T細胞比例發(fā)現：成年鼠在給藥3天后顯著降低至36%，7天后可恢復至正常值，但是4周后再次下跌至26%。幼年鼠在給藥3天后，CD4+T細胞比例小幅下降至89%，7天后即可恢復至正常值，變化趨勢與成年鼠不同。老年鼠損傷、恢復情況與成年鼠類似，見圖3-A。

對比CD8+T細胞比例發(fā)現：成年鼠在給藥3天后，CD8+T細胞比例顯著下降至35%，7天后可恢復至正常值，但4周后再次下跌至13%。幼年鼠在給藥3天后，CD8+T細胞比例下降至71%，7天后即可恢復至正常值范圍，變化趨勢與成年鼠不同。老年鼠損傷、恢復情況與成年鼠類似，見圖3-B。

對比CD4+CD8+T細胞比例發(fā)現：成年鼠在給藥3天后，CD4+CD8+T細胞比例顯著下降至18%，7天后可恢復至正常值，但4周后再次下降至3%。幼年鼠在給藥3天后，CD4+CD8+T細胞比例下降至63%，第7天可恢復至正常值范圍，至第28天，再次下降至77%，變化趨勢與成年鼠不同。老年鼠損傷、恢復情況與成年鼠類似，見圖3-C。

圖3 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠胸腺淋巴細胞分型的影響

A:胸腺CD4+細胞比例；B:胸腺CD8+T細胞比例；C:胸腺CD4+CD8+T細胞比例

注：N=5；與同時間成年鼠相比，*P＜0.05

4環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠脾臟淋巴細胞分型的影響

調節(jié)性T（Treg）細胞在調控T細胞的發(fā)育和功能中起重要作用。在分析胸腺細胞分型的基礎上，我們進一步觀察了環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠脾臟細胞分型的影響。未給藥時，幼年鼠B細胞比例顯著低于成年鼠；Treg細胞顯著高于成年鼠。老年鼠B細胞、Treg細胞比例均顯著低于成年鼠，見表4。

表4 不同年齡小鼠脾臟淋巴細胞分型檢測

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注：1）N_{幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12}

給藥后，對比B細胞比例：成年鼠在給藥后，B細胞比例持續(xù)走低，第14天達最低值43%，4周后可恢復至86%。幼年鼠、老年鼠在給藥后，B細胞比例無明顯變化，均與成年鼠變化趨勢不同，見圖4-A。

對比Treg細胞比例發(fā)現：成年鼠在給藥3天后，Treg細胞比例下降至59%，至第7天下降至最低值4%，4周后可恢復至126%。幼年鼠損傷情況與成年鼠類似，但4周后僅能恢復至66%。老年鼠損傷、恢復情況與成年鼠類似，見圖4-B。

圖4環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠脾臟淋巴細胞分型的影響

A:脾臟B細胞比例；B:脾臟Treg細胞比例

注：N=5；與同時間成年鼠相比，*P＜0.05

5 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠外周血淋巴細胞分型的影響

在分析脾臟細胞分型的基礎上，我們進一步觀察了環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠外周血淋巴細胞分型的影響。未給藥時，幼年鼠NK細胞與成年鼠比例相近；B細胞、巨噬細胞隨著年齡的增長，至第28天與成年鼠比例相近；CD4+T細胞、CD8+T細胞存在反跳后回落現象，至第28天與成年鼠比例相近。老年鼠巨噬細胞、CD8+T細胞與成年鼠比例相近；NK細胞比例高于成年鼠；CD4+T細胞比例低于成年鼠，見表5。

表5 不同年齡小鼠外周血淋巴細胞分型檢測

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注：1）N幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12

給藥后，對比NK細胞比例發(fā)現：成年鼠在給藥7天后NK細胞比例下降至 29%，至第28天，經過小幅反跳后恢復至106%。幼年鼠在給藥后第3天，NK細胞比例無明顯變化，至第7天，上升至149%，至第28天依然維持該水平，變化趨勢與成年鼠不同。老年鼠在給藥3天后，NK細胞比例下降至53%，至第28天，依然維持該水平，變化趨勢與成年鼠不同，見圖5-A。

對比B細胞絕對數發(fā)現：成年鼠在給藥后第3天，B細胞比例驟降至2%，至第7天，可恢復至45%，第14天反跳至122%，4周后回落到57%。幼年鼠損傷及恢復趨勢與成年鼠類似，恢復情況優(yōu)于成年鼠。老年鼠在給藥后第3天，B細胞比例驟降至1%，至第7天，可恢復至25%，至第28天，一直維持該水平，恢復趨勢與成年鼠不同，且恢復能力弱于成年鼠，見圖5-B。

對比巨噬細胞比例發(fā)現：成年鼠在給藥3天后，巨噬細胞比例驟降至20%，至第7天反跳至192%，至第28天可恢復至正常值。幼年鼠變化趨勢與成年鼠類似。老年鼠：在給藥后第3天，巨噬細胞比例驟降至14%，至第7天回升到144%，至第28天回落到56%，變化趨勢與成年鼠不同，見圖5-C。

對比CD4+T細胞絕對數發(fā)現：成年鼠在給藥3天后，CD4+T細胞比例驟降至4%，至第7天即可恢復正常值范圍。幼年鼠在給藥3天后，CD4+T細胞比例下降至30%，至第7天僅能恢復至47%，第14天可恢復正常值范圍，恢復能力弱于成年鼠。老年鼠在給藥3天后，CD4+T細胞比例驟降至1%，7天后僅能恢復至58%，第14天小幅回升，至第28天跌至63%，恢復情況弱于成年鼠，見圖5-D。

對比CD8+T細胞絕對數發(fā)現：成年鼠在給藥3天后，CD8+T細胞比例驟降至3%，至第7天，可恢復至70%，第14天時小幅回升，至第28天可恢復至正常值。幼年鼠在給藥后第3天，CD8+T細胞比例下降至20%，7天可恢復至39%，2周時可恢復至122%，恢復能力弱于成年鼠。老年鼠在給藥后第3天，CD8+T細胞比例驟降至3%，至第7天可恢復至83%，此后仍維持該水平，恢復情況弱于成年鼠，見圖5-E。

圖5 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠外周血淋巴細胞分型的影響

A:外周血NK細胞比例；B:外周血B細胞比例；C:外周血巨噬細胞比例；

D:外周血CD4+T細胞比例；E:外周血CD8+T細胞比例

注：N=5；與同時間成年鼠相比，*P＜0.05

6 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠血漿IgA、IgG、IgM含量的影響

在分析外周血淋巴細胞分型的基礎上，我們進一步觀察了環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠血漿IgA、IgG、IgM的影響。未給藥時，幼年鼠IgA、IgM含量與成年鼠相近，IgG含量顯著高于成年鼠。老年鼠IgA、IgG、IgM含量均顯著高于成年鼠，見表6。

表6 不同年齡小鼠血漿IgA、IgG、IgM含量檢測

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注：1）N_{幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12}

給藥后，對比血漿IgA含量發(fā)現：成年鼠在給藥后第3天，IgA含量下降至7%，至第2周，依然維持在較低水平，至第4周可恢復至83%。幼年鼠在給藥后第3天，IgA含量下降至62%且至第4周可完全恢復。損傷恢復情況優(yōu)于成年鼠。老年鼠變化趨勢與成年鼠基本一致。

對比血漿IgG含量發(fā)現：成年鼠在給藥后第3天，IgG含量驟降至5%，至第7天，依然維持較低水平且4周只能恢復至原來的50%。幼年鼠在給藥后第7天，IgG含量下降至38%，至第2周即可完全恢復。老年鼠損傷情況與幼年鼠相似，但恢復緩慢，至第4周只能恢復至75%。

對比血漿IgM含量發(fā)現：成年鼠在給藥后第3天，IgG含量降至37%，至第4周可完全恢復。幼年鼠、老年鼠變化情況與成年鼠基本一致。

圖6 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠血漿IgA、IgG、IgM含量的影響

A:血漿IgA含量；B:血漿IgG含量；C血漿IgM含量

注：N=5；與同時間成年鼠相比，*P＜0.05

1動物分組與模型制備幼年（3周齡，10 g左右）、青年（8周齡，22 g左右）、老年（14月齡，30 g左右）雄性C57BL/6J小鼠（SPF級）各32只購于北京華阜康生物科技股份有限公司。CTX組成年鼠、老年鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，分兩次隔天給藥，50mg/kg/次。幼年鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺劑量為72mg/kg【同種動物間劑量換算公式：Dose(b)=Dose(a)×(Wb/Wa)2/3,W為體重(Kg)】，分兩次隔天給藥，36mg/kg/次。對照組腹腔注射等劑量生理鹽水。分別于給藥后第3天，7天，2周，4周檢測各年齡小鼠造血免疫指標。

2 主要試劑與儀器NK1.1 ，CD11b， F4/80，CD4，CD25，Foxp3抗體購自eBioscience公司；Foxp3 Buffer Set，CD8a，B220抗體購自BD公司。注射用環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（產品批號：14092925）。小鼠ELISA試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司（產品批號：70-E-EK2742(IgA) 、70-E-EK2712(IgG)、70-E-EK2762(IgM)）。137Csγ射線照射源，加拿大原子能有限公司，GAMMA-CELL40，劑量率0.80Gy/min。流式細胞儀C6（美國BD），全自動血液分析儀MEK-7222K（日本光電），酶標儀MK3（ThermoMultiskan）

3模型評價方法

3.1外周血血常規(guī)檢測 給藥后第3天、7天、2周、4周，小鼠眼內眥取血，EDTA-K3 抗凝，用全自動血細胞計數儀測定白細胞數（WBC）、淋巴細胞數、淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比。

3.2 器官指數測定小鼠稱重后取小鼠胸腺、脾臟稱重，計算胸腺、脾臟指數（器官指數=器官重量（mg）/小鼠體重（g））。

3.3 外周血IgA、IgG、IgM測定取10ul抗凝血漿，稀釋10000倍備用。復孔加入50ul1×檢測緩沖液和50ul 2倍倍比稀釋的標準品。15分鐘內，樣本孔加入90ul 1×檢測緩沖液和10ul預稀釋的樣本。室溫孵育2小時。洗滌后每孔加入100ul稀釋的檢測抗體。室溫孵育1小時。洗滌后每孔加入100ul顯色底物，避光，室溫孵育5-30分鐘。每孔加入100ul終止液。在450nm波長檢測OD值。

3.4外周血淋巴細胞分型測定每管取50ul抗凝血，按照流式表面染色方法分別標記CD4/CD8a和NK1.1/F4/80/B220/CD11b。室溫避光孵育30min，加入1ml 紅細胞裂解液，室溫裂解10min。1000r/min離心5min后棄上清，緩沖液洗滌1次后加入300ulPBS，4°C保存待檢。用流式細胞儀檢測NK細胞、巨噬細胞（CD11b+F4/80+）、B細胞、CD4+T細胞，CD8a+T細胞比例。外周血B220細胞，CD4+T細胞，CD8a+T細胞絕對數計算方法：細胞數（109/L）=B220細胞，CD4+T細胞，CD8a+T細胞在總細胞中占比×淋巴細胞數。

3.5脾臟淋巴細胞分型測定制備脾細胞懸液，調整細胞濃度為10^7 /ml，取100ul 細胞懸液加到EP管中。按照流式表面染色方法標記CD4/B220/CD25。4°C避光孵育30min，加入1ml 紅細胞裂解液，室溫避光裂解10min。1000r/min離心5min后棄上清，緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。分別使用Foxp3 Fixation/permeabilizationbuffer，permeabilization buffer 處理細胞，按照流式表面染色方法標記FOXP3，室溫避光孵育20min。1000r/min離心5min后棄上清，緩沖液洗滌1次后加入300ulPBS，4°C保存待檢。用流式細胞儀檢測B細胞、Treg細胞(CD4+CD25+FOXP3+)比例。

3.6胸腺淋巴細胞分型測定 制備胸腺細胞懸液，調整細胞濃度為10^7 /ml，取100ul 細胞懸液加到EP管中。按照流式表面染色方法標記CD4/CD8。4°C避光孵育30min，1000r/min離心5min后棄上清，緩沖液洗滌1次后加入300ulPBS，4°C保存待檢。用流式細胞儀檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD8+T細胞比例。

3.7統(tǒng)計學方法采用Prism5軟件處理數據、作圖。各指標間兩組實驗數據的比較采用t檢驗，數據以均數±標準差（`X±s）表示。

1、造模因素信息

環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是進入人體內被肝臟或腫瘤內存在的過量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，變?yōu)榛罨饔眯偷牧柞０返娑鹱饔玫牡骖愌苌?。抗瘤譜廣，是第一個所謂“潛伏化”廣譜抗腫瘤藥，對白血病和實體瘤都有效。同時作為免疫抑制劑，用于各種自身免疫性疾病，如嚴重類風濕性關節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、兒童腎病綜合征、多發(fā)性肉芽腫、天皰瘡以及潰瘍性結腸炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜等。也用于器官移植時抗排斥反應，通常與潑尼松、抗淋巴細胞球蛋白合用。

2、實驗動物背景信息

健康幼年（3周齡，10 g左右）、青年（8周齡，22 g左右）、老年（14月齡，30 g左右）雄性C57BL/6J小鼠（SPF級）。

3、研究背景

接受藥物治療的患者中，有相當一部分是特殊人群，如新生兒、嬰幼兒、兒童、妊娠期和哺乳期婦女、老年人等，因其生理、生化和病理等機制與普通人群存在較大差異，有著不同的藥代動力學和藥效學特征，用藥安全形勢十分嚴峻。

免疫系統(tǒng)可以對病原體侵入人體做出適度反應，從而保持人體的內環(huán)境穩(wěn)定。免疫系統(tǒng)的免疫應答可分為固有免疫和獲得性免疫。固有免疫細胞是機體非特異免疫的重要組成部分，包括中性粒細胞、NK 細胞等；獲得性免疫包括參與體液免疫的B 細胞及參與細胞免疫的T 細胞等。一般來說，人至青春期免疫系統(tǒng)才發(fā)育成熟，兒童免疫細胞表現出數量不足和功能不成熟。成年人的免疫系統(tǒng)日趨成熟，隨著年齡的增長，人的免疫功能逐漸衰退，60 歲以上老人T 細胞、B 細胞、NK 細胞等會出現生成數量減少或代謝活力下降等現象。

少年兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，疾病譜與成年人多有不同。所以在用藥方面在考慮有效性的同時還要考慮用藥安全尤其的遠期的安全性，以保證患者痊愈后的生存質量。如抗腫瘤藥物的研發(fā)，兒童腫瘤多來源于中胚層，在藥物選擇性上與成年人不同。對藥物的代謝差異也影響到了藥物毒副作用尤其是對健康的遠期影響都需要注意。

老年人視為“特殊人群”，因為他們在共病多、同時使用多種藥物，在藥代動力學、發(fā)生藥物不良反應（ADR）方面與年輕人不同。醫(yī)療實踐通?；趶呐R床試驗中得出的單一疾病指南，這些臨床試驗不包括體弱的老年人或患有多種疾病的人。這些則易導致老年人用藥不良反應事件增加。

綜上，在臨床前安全性研究中，采用幼年及老年動物進行實驗觀察逐年來引起了重視，是為臨床用藥提供參考數據。

環(huán)磷酰胺作為一種免疫抑制劑，已有大量研究表明其能抑制體液和細胞免疫應答，對B 細胞損傷作用尤為明顯。本研究利用幼年鼠及老年鼠制備CTX免疫模型，觀察CTX處理后不同年齡小鼠免疫細胞損傷及恢復情況，為特殊人群用藥提供模型。

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