艾滋病異常免疫激活動物模型的建立是在感染前就開始樣本收集，SIV靜脈攻毒后98天開始為期3個月的ART治療，并在停藥后繼續(xù)觀察1個月。除了病毒載量及CD4的持續(xù)監(jiān)測，還檢測整個疾病過程中T細胞激活情況以及細胞因子的變化。通過疾病控制階段與病毒陰性階段，我們發(fā)現(xiàn)ART后免疫狀態(tài)恢復(fù)，但一些細胞因子和免疫細胞仍處于高水平。盡管，停藥后的病毒反彈階段和慢性感染階段都有著高血漿病毒載量。但是，通過對比發(fā)現(xiàn)停止ART之后，病毒的免疫激活狀態(tài)與未治療階段有一定差異。特別是，我們的數(shù)據(jù)顯示促炎因子TNF-α，IL-6, IL-1β，IFN-γ的水平顯著升高。相較于SE階段，升高的促炎因子水平可能預(yù)示停藥后面臨更嚴峻的病毒復(fù)制和免疫激活，提示ART持續(xù)治療的重要性。

綜上，艾滋病異常免疫激活動物模型研究結(jié)果顯示，盡管給予ART治療，但持續(xù)的免疫激活仍然存在。血清中的細胞因子和T細胞亞群依然高于正常水平。因此，有效的抗病毒治療之外，也需要臨床的治療干預(yù)抑制機體異常的免疫激活狀態(tài)。此外，停止給藥后，血清中促炎因子水平顯著高于慢性感染階段。提示停藥后伴隨病毒復(fù)制，可能出現(xiàn)更嚴峻的免疫激活，增加后續(xù)治療的難度，在臨床上實驗性停藥研究中必須進一步評估免疫狀態(tài)的影響。

1.本實驗所用的SIVmac239病毒，在研究所已完成風險評估，具有完整的標準操作程序，全部動物實驗活動在ABSL-3實驗室中進行。

2.本次申報的新資源“艾滋病異常免疫激活動物模型”在實驗過程中嚴格遵守研究所生物安全規(guī)章制度和動物實驗規(guī)章制度，遵循SIVmac239病毒風險評估和標準操作程序。

3.感染動物實驗的開展獲得IACUC委員會批準（IACUC號：XJ19005）。

1、病毒載量變化情況：

SIVmac239感染恒河猴后，造成血漿病毒血癥。通過給予抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART），將血漿病毒載量抑制在低水平或基本檢測不到的水平，停止ART治療，血漿病毒載量出現(xiàn)反彈。

圖1 SIVmac239感染恒河猴模型病毒載量的變化情況

2、CD4絕對數(shù)和CD4/CD8的變化情況：

利用流式細胞術(shù)，檢測感染猴外周血中的CD4+細胞數(shù)及CD4/CD8，判斷ART治療后感染猴免疫功能是否有所恢復(fù)。結(jié)果顯示，SIV感染恒河猴在慢性感染階段（SE）CD4絕對數(shù)持續(xù)下降；經(jīng)ART治療后，血漿病毒載量呈低水平復(fù)制，同時CD4細胞數(shù)上升，與SI階段無顯著差異,停藥之后，CD4細胞數(shù)會再次減少。有些個體在慢性感染階段出現(xiàn)CD4/CD8比值倒置，在進行藥物治療后，隨著病毒載量的降低，CD4/CD8倒置現(xiàn)象緩解，停藥后可能再次出現(xiàn)CD4/CD8倒置（圖2）。

圖2 SIVmac239感染恒河猴模型CD4絕對數(shù)和CD4/CD8的變化情況

3、病毒DNA變化情況

利用Total DNA檢測方法，我們在整個階段對的病毒DNA進行跟蹤，在進行藥物治療后病毒DNA呈下降趨勢（圖3），但不同于vRNA，并沒有降至檢測線以下。停藥后，SIV DNA顯著小于與SE。提示在慢性感染階段進行ART治療并不能有效清除病毒的DNA（圖3）。

圖3 SIVmac239感染恒河猴模型病毒DNA變化情況

4、免疫細胞亞群的變化情況：

為了了解這些免疫細胞亞群在各階段的水平，我們利用多色流式對PBMC中的免疫相關(guān)的T細胞亞群進行分析比較。CD38和HLA-DR是公認的免疫激活標志物。我們發(fā)現(xiàn)CD4+CD38+HLA-DR-亞群在ART治療后，顯著高于SI階段。而其它三個亞群 (CD4+CD38-HLA-DR+, CD4+CD38+HLA-DR+, CD4+CD38-HLA-DR-）經(jīng)過ART治療，與未感染階段水平相當。同樣的結(jié)果也在CD8+T細胞中發(fā)現(xiàn)，CD8+CD38+HLA-DR-亞群比例顯著高于SI（圖4A, 左圖）。上述結(jié)果提示，經(jīng)過ART治療，CD38+HLA-DR-在T細胞中未能恢復(fù)至感染前水平。無論是在CD4細胞還是CD8細胞中，CD38和HLA-DR各亞群在SE和SR階段水平相似（圖4A,右圖）。

T細胞亞群在治療階段的比例與未感染階段相當，同樣病毒反彈后的T細胞亞群比例與未治療時無顯著差異（圖4B）。值得關(guān)注的是，盡管經(jīng)過ART治療，PD-1+在記憶T細胞亞群中的表達仍處于高水平（圖4C, 左圖）。此外，結(jié)果顯示，與CD8+細胞不同，在病毒反彈后，CD4+T細胞中PD-1/TCM顯著升高，然而PD-1/TEM卻低于SE階段（圖4C,右圖）。

圖4SIVmac239感染恒河猴模型免疫細胞變化情況的比較

5、細胞因子的變化情況：

為了了解病毒控制期間細胞因子與未感染病時的差異，利用Luminex檢測了不同階段的血清中細胞因子的水平。由于ART介入大部分細胞因子異常激活得到緩解。但仍有一些趨化因子，比如MIP-1β和IL-8顯著高于正常值的。此外，結(jié)果顯示抗炎因子IL-10也高于正常水平（圖5, 左圖）。

通過SE與SR比較，發(fā)現(xiàn)病毒反彈后促炎因子的水平顯著升高，包括TNF-α，IL-6，IL-1β以及IFN-γ（圖5）。

圖5SIVmac239感染恒河猴模型細胞因子變化情況的比較

1、實驗材料：SIVmac239病毒；選用體重4-6 kg的SPF恒河猴。實驗前體檢無異常，必須排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相關(guān)的4種基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）篩查結(jié)果為陰性。所有感染動物必須在ABSL-3室中進行。

2、 靜脈途徑SIV恒河猴感染模型制作方法：先用寵物用電推剪推去猴上肢采血部位的猴毛，左手抓住一側(cè)后肢跗關(guān)節(jié)部位，使后肢皮下靜脈怒張。用75%酒精酒精棉球消毒。右手拿吸取病毒液的注射器，針頭沿靜脈平行方向向向心端刺入血管，見回血后，左手放松，不再緊壓，右手緩慢將病毒液推入。完畢后用干棉球壓迫止血，將注射器拔出，棄在利器專用桶內(nèi)。

3、 給藥方法：經(jīng)皮下注射1ml ART藥液（TFV+FTC+DTG），每天給藥一次，連續(xù)給藥3個月。

4、 樣本收集和檢測：按照以下實驗方案對動物進行監(jiān)測和樣本采集，檢測病毒RNA，CD4絕對數(shù)，病毒DNA，免疫細胞以及血清中的細胞因子。

圖1實驗設(shè)計及樣本收集

一、疾病概述

艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系統(tǒng)嚴重損害為特征的傳染性疾病，是20世紀危害人類健康和生命最嚴重的病毒性疾病之一。自美國CDC報道首例艾滋病后，到20世紀80年代中期艾滋病發(fā)展成為一個性的流行病。截止2019年底，HIV已感染3800萬人，2019年新增感染者170萬，2019年因艾滋病死亡69萬人。艾滋病在1985年傳入我國，2019年，累計報告艾滋病71204例，死亡20999例。艾滋病早已成為關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會熱點問題，艾滋病的預(yù)防與治療也成為當代生物醫(yī)學研究的前沿熱點之一。

二、模型背景

1、病原）信息

感染毒株為SIVmac239，由美國Aaron Diamond艾滋病研究中心Preston. Marx博士惠贈，本實驗室使用中國恒河猴PBMCs擴增制備。它具有高度復(fù)制能力、CXCR4受體嗜性，并且能經(jīng)粘膜傳播，這些特性使它在研究HIV感染和發(fā)病機制及評價AIDS候選疫苗的功效方面具有重要的現(xiàn)實意義。

2、實驗動物背景信息

選用體重4-6 kg的SPF恒河猴。實驗前體檢無異常，必須排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相關(guān)的4種基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）篩查結(jié)果為陰性。所有感染動物必須在ABSL-3實驗室中進行。

3、研究背景

HIV感染伴隨著異常的免疫激活，導致HIV感染者免疫功能障礙，推動了疾病進展。這種異常的免疫激活也是導致非艾滋病定義性疾病，包括心血管疾病神經(jīng)認知能力下降以及惡性腫瘤的主要原因。

抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的干預(yù)能有效抑制病毒復(fù)制至檢測不到的水平，恢復(fù)免疫系統(tǒng)的功能并降低免疫激活。然而與未感染者相比，T細胞表面仍有過表達的活化標記物，異常高水平的炎癥和免疫激活持續(xù)存在。研究表明，ART降低免疫激活的效率決定了ART有效重建免疫系統(tǒng)的潛力，進而影響疾病的進展。因此，研究病毒控制期間免疫細胞及免疫活化分子表達的改變, 并將其與未感染階段的對比，對于了解ART緩解免疫激活的療效，研究病毒抑制期間的異常免疫激活與疾病進展之間的關(guān)系具有重要意義。此外，對病毒反彈后免疫激活水平的研究，將幫助我們評估停藥后的風險有重要價值。但是, 由于倫理限制以及臨床上很難獲得病人感染前和早期感染階段的樣本，目前國內(nèi)外缺乏病毒感染以及ART治療整個病程的持續(xù)追蹤報道。艾滋病異常免疫激活動物模型可以幫助我們檢測整個過程的免疫激活情況。