1、2/3肝切除誘導(dǎo)的肝再生模型的鑒定和評(píng)價(jià)的技術(shù)方法和指標(biāo)體系主要分三個(gè)層面：

（1）整體水平：小鼠的整體健康狀況良好，在術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠的肝臟質(zhì)量能夠逐漸恢復(fù)。

（2）病理水平：對(duì)肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)染色，檢測(cè)肝臟細(xì)胞的增殖水平。

（3）分子水平：檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA和蛋白水平。

2、該模型主要是采用2003年時(shí)Greene和Puder開發(fā)的小鼠部分肝切除技術(shù)，結(jié)合后續(xù)不斷改進(jìn)的方法，增加鎮(zhèn)痛劑加熱墊等的使用。

3、該模型的整體操作過程相對(duì)比較簡(jiǎn)單，難點(diǎn)在于如何保持手法的一致性，以保證結(jié)果的差異不是由于操作上的不同引起的。肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并在組織丟失后再生的能力為研究肝細(xì)胞增殖和器官再生的調(diào)控提供了一個(gè)有效的模型，為終末期肝臟疾病需要行切除手術(shù)患者的術(shù)后治療提供了更加豐富的理論研究基礎(chǔ)，從而促進(jìn)新的治療手段的開發(fā)。

本模型制作不涉及微生物。

動(dòng)物模型制備過程中遵循福利和各項(xiàng)管理度，并未傳代，于SPF屏障環(huán)境下飼養(yǎng)，動(dòng)物無(wú)逃逸。

模型制備完成后，在進(jìn)行病理染色析對(duì)環(huán)境和生態(tài)并未產(chǎn)明顯影響。

1、細(xì)胞/基因/病原/蛋白表達(dá)/免疫組化鑒定、病原學(xué)檢查信息

2/3肝切除手術(shù)誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞增殖，通過H&E和BrdU染色可見術(shù)后小鼠肝臟細(xì)胞明顯的增殖，統(tǒng)計(jì)肝重體重比也發(fā)現(xiàn)肝臟質(zhì)量的恢復(fù)（圖1）。

圖1. 模型小鼠肝臟細(xì)胞有絲分裂和增殖（A-B）明顯增加，肝重體重比也逐漸恢復(fù)（C）。（PHx, 2/3 partial hepatectomy;LW, liver weight; BW, Body weight）。

2、表型分析（包括生理生化、解剖學(xué)、生物學(xué)特征等）

大體解剖并未發(fā)現(xiàn)小鼠各臟器有明顯異常。

3、影像/行為/臨床/病理表型

模型小鼠的行為未出現(xiàn)明顯異常。

評(píng)價(jià)方法：

1）小鼠術(shù)后狀態(tài)的恢復(fù)。

通過觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)及進(jìn)食情況判斷2/3肝切除手術(shù)術(shù)后小鼠整體健康狀況是否恢復(fù)。

2)肝臟細(xì)胞增殖及肝臟生長(zhǎng)情況。

該模型通過在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)取材，一方面通過對(duì)小鼠肝臟質(zhì)量和體重進(jìn)行稱重，統(tǒng)計(jì)肝重體重比，另一方面通過對(duì)肝臟組織進(jìn)行病理染色判斷肝臟細(xì)胞的增殖和肝臟的生長(zhǎng)情況。

評(píng)價(jià)指標(biāo)：

主要指標(biāo)：

1）肝重體重比逐漸恢復(fù)。

2）肝臟細(xì)胞有絲分裂在增殖期顯著增加。

3）肝臟細(xì)胞增殖在增殖期顯著增加。

重要指標(biāo)：小鼠活動(dòng)、進(jìn)食及體重變化。

實(shí)驗(yàn)材料（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑、儀器）

動(dòng)物：C57BL/6小鼠

試劑：異氟烷

器械及儀器：異氟烷汽化器、半彎曲顯微手術(shù)剪、持針器、直頭無(wú)齒微型解剖、彎頭解剖鑷、16cm直頭組織剪、針托、回形針（用于自制拉鉤）、棉簽、酒精棉球、5ml注射器針頭兩個(gè)（固定拉鉤）、醫(yī)用膠布（固定小鼠）、聚苯乙烯泡沫塑料墊、1ml注射器（液體麻醉注射用）、3-0絲線（結(jié)扎肝葉）、4-0絲線（縫合腹膜）、縫合皮膚：訂書機(jī)閉合/4-0尼龍線縫合

實(shí)驗(yàn)環(huán)境

動(dòng)物手術(shù)在SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室生物安全柜中操作。

實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程

1）抓取小鼠，稱重并記錄。

2）左手固定住小鼠，右手持裝有適量異氟烷的麻醉裝置，將小鼠的口鼻部暴露在異氟烷氣體中。麻醉過程中應(yīng)持續(xù)觀察小鼠的反應(yīng)，掌握好麻醉深度。

3）待完全麻醉后，將小鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，術(shù)中持續(xù)給予吸入麻醉，維持適當(dāng)?shù)穆樽砩疃?。用剃毛機(jī)剔除小鼠腹部的毛發(fā)，75%乙醇消毒后準(zhǔn)備手術(shù)。

4）在小鼠腹部靠近肝臟的位置，用剪刀沿著腹部中線將表面皮膚剪開一個(gè)小口（長(zhǎng)度約為1.5-2.0cm），用鑷子小心夾起小鼠腹膜，沿著剛才的切口將腹膜剪開，暴露腹腔，注意避開血管。

5）用浸泡在PBS中滅菌過的棉簽小心的將肝臟分離出來(lái)，用眼科剪剪斷和肝臟相連的韌帶，充分游離、暴露肝臟。

6）用浸泡在PBS中的醫(yī)用縫合線（5-0）從根部將小鼠左側(cè)葉結(jié)扎，隨即將該葉剪下。接著用同樣的方法將中間葉一并結(jié)扎并剪下。操作過程注意動(dòng)作輕柔，避免損傷其他肝葉，線要扎緊，避免脫落。

7）用棉簽將殘余肝臟小心的送回至原有位置，隨后依次用5-0和4-0的醫(yī)用縫合線縫合腹膜和皮膚?？p好后，消毒縫合口和周圍皮膚，停止麻醉。

8）手術(shù)結(jié)束后將小鼠放在37度恒溫加熱墊上等待蘇醒，最后將蘇醒后的小鼠安置在干凈的鼠籠中正常飼養(yǎng)、觀察。

肝病影響著全世界數(shù)百萬(wàn)人。在大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家，由于疾病預(yù)防、診斷和治療方面的現(xiàn)代進(jìn)步，病毒性肝炎的發(fā)病率正在下降。在包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家，擴(kuò)大乙肝病毒系統(tǒng)免疫規(guī)劃也大大降低了新病例數(shù)量。但是，隨著生活水平的提高，包括非酒精性脂肪肝和酒精相關(guān)肝病在內(nèi)的代謝性肝病的患病率逐漸上升，這些肝病最終可能導(dǎo)致更多的終末期肝病(肝功能衰竭、肝硬化和肝癌)的發(fā)生[9]。根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)2018年的一份報(bào)告，中國(guó)的肝癌發(fā)病率居世界第九位，僅次于蒙古、埃及、岡比亞、越南、老撾、柬埔寨、幾內(nèi)亞和泰國(guó)等少數(shù)發(fā)展中或新興經(jīng)濟(jì)體。但從中國(guó)的人口規(guī)模來(lái)看，中國(guó)無(wú)疑是世界上肝癌患者最多的國(guó)家(2019年14億)[10]。由于原發(fā)性肝癌早期缺乏明顯的特異癥狀，常規(guī)的放療和化療的治療效果無(wú)明顯效果，肝臟病變部位切除是治療的重要途徑。如何有效地發(fā)掘肝臟再生潛能是術(shù)后病人得以存活的關(guān)鍵，因此，對(duì)肝臟的再生機(jī)理進(jìn)行研究對(duì)于肝臟疾病的治療具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

2/3肝切除誘導(dǎo)的肝再生動(dòng)物模型，最早是1931年由Higgins和Anderson在大鼠中使用，他們切除了大鼠四葉肝臟中的兩葉（約占整個(gè)肝臟的2/3），用于研究肝臟再生。在后續(xù)的研究中因?yàn)榇笫蟊刃∈蟠螅僮飨鄬?duì)方便，所以大多數(shù)人選擇大鼠進(jìn)行肝再生的研究[11-14]。2003年時(shí)Greene和Puder為開發(fā)了一種新穎、快速且安全的小鼠部分肝切除技術(shù)[15]，他們確定了小鼠肝臟七個(gè)葉的相對(duì)貢獻(xiàn)，并切出來(lái)左前葉、左后葉和右前葉切除，大約占總肝臟體積的68%。同時(shí)作者還將手術(shù)的麻醉方法改為異氟烷氣體麻醉代替?zhèn)鹘y(tǒng)的三溴乙醇、氯胺酮和戊巴比妥，并把小鼠放在加熱墊上防止小鼠體溫流失，從而減少小鼠因手術(shù)引起的死亡。隨后小鼠2/3肝切除技術(shù)逐漸成熟[16-18]。其中，2008年時(shí)Claudia Mitchell 和Holger Willenbring對(duì)小鼠2/3肝切除手術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步的改進(jìn)：作者在進(jìn)行肝葉切除時(shí)，將三步改成兩步，首先切除小鼠肝臟的左后葉，再將小鼠的中間葉（左前葉和右前葉）一起切除，這種手術(shù)方法會(huì)將小鼠膽囊摘除[18]。2014年時(shí)該課題組對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛、麻醉劑的選擇及體溫的控制也給出了如下補(bǔ)充：（1）為了防止麻醉下的小鼠體溫過低，在整個(gè)手術(shù)過程中將小鼠放在暖墊上。（2）術(shù)后關(guān)閉腹膜后，在關(guān)閉皮膚前，將0.25% (wt/vol)鹽酸布比卡因溶液(最大劑量8 mg/kg)滴于切口處。（3）術(shù)后使用鹽酸丁丙諾啡0.1 mg/kg維持鎮(zhèn)痛，之后每8-12小時(shí)注射一次，直到術(shù)后第2天結(jié)束[19]。后續(xù)關(guān)于小鼠肝再生模型的構(gòu)建多采用以上兩種方法。