我們通過野生BALB/c 小鼠、galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠和galectin-7沉默小鼠進(jìn)行的質(zhì)譜分析、Western bloting以及免疫共沉淀，我們發(fā)現(xiàn)Galectin-7與細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)包括肌球蛋白輕鏈-3，肌鈣蛋白C，肌動蛋白-1，角蛋白-13和中間絲相關(guān)蛋白相互作用，并參與細(xì)胞凋亡調(diào)控。有關(guān)Galectin-7在哮喘中的作用未見國內(nèi)外報道，這些結(jié)果對于深入了解哮喘的發(fā)病機(jī)制有重要的意義，可用于哮喘的診斷和風(fēng)險預(yù)測，并作為未來治療的靶點。

實驗動物制備后在屏障環(huán)境繁育，3-4月齡脫頸椎處死，取肺組織進(jìn)行檢測。動物尸體統(tǒng)一放入冰柜處理。實驗動物使用通過了醫(yī)學(xué)實驗動物研究所倫理委員會批準(zhǔn)（ILAS-PG-2014-010）

我們對該基因修飾小鼠進(jìn)行質(zhì)譜分析，注：野生BALB/c小鼠（114#），galectin-7沉默小鼠（115#），galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠（116#）。差異倍數(shù)≥1.2或差異倍數(shù)≤0.833，所得結(jié)果進(jìn)入分析。共篩選出1009個差異蛋白。兩兩比較，已知蛋白如下表。發(fā)現(xiàn)Galectin-7的相關(guān)蛋白：細(xì)胞骨架類：肌球蛋白輕鏈3（Myosinlight chain 3）、肌球蛋白（Myosin-1）、肌動蛋白（Actin1）、肌鈣蛋白C（TroponinC）、中間絲相關(guān)蛋白（Repetin）、角蛋白4（Keratin-4）,角蛋白13（Keratin-13）,肌集鈣蛋白（Calsequestrin）、肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶鈣（Sarcoplasmic/endoplasmicreticulum calcium ATPase）；物質(zhì)轉(zhuǎn)運：二磷酸甲羥戊酸脫羧酶（Diphosphomevalonatedecarboxylase）；急性時相蛋白：α1-酸性糖蛋白2（Alpha-1-acidglycoprotein 2）或血清淀粉樣蛋白A（Serumamyloid A protein）。

野生BALB/c小鼠（114#），galectin-7沉默小鼠（115#），galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠（116#）差異蛋白。

免疫共沉淀結(jié)果：發(fā)現(xiàn)在野生BALB/c小鼠，galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠和galectin-7干擾小鼠中都存在Galectin-7，且在3組間都發(fā)現(xiàn)Galectin-7與肌球蛋白輕鏈-3，肌鈣蛋白C，肌動蛋白-1，角蛋白-13和中間絲相關(guān)蛋白有相互作用。

野生BALB/c小鼠，galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠和galectin-7沉默小鼠中g(shù)actin-7相互關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)

注：野生BALB/c小鼠（陰性組），galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠（SPC組）和galectin-7干擾小鼠（Anti組）。

（1）將galectin-7CDNA序列輸入網(wǎng)上的基因沉默片斷選擇軟件，選擇沉默的發(fā)夾DNA。DEFINITION Mus musculus lectin, galactose binding,soluble 7 (Lgals7)CDNA

C A G C G A C T G G C CA C A T T G TGATGGAAAGGGAGGAGCTGAACCACTACCTTGCCTTTACTTAAGGTCCCCTCCCACAGCGACTGGCCACATTGTTGCTGTATTGCTGTGCCCGCCATGTCTGCTACCCAGCACAAGACCTCCCTGCCTCAGGGCGTCCGCGTGGGCACTGTCATGAGAATTCGAGGCATGGTCCCTGACCAGGCTGGCAGGTTCCATGTAAACCTGCTATGCGGTGAGGAGCAAGGAGCAGATGCCGCCTTGCACTTTAACCCGAGGCTGGACACTTCCGAGGTTGTCTTCAACACCAAAGAACAAGGCAAATGGGGCCGTGAGGAGCGAGGCACCGGCATCCCCTTCGAGCGTGGGCAGCCCTTTGAAGTGCTCCTCATCGCCACAGAGGAAGGCTTCAAGGCTGTGGTCGGGGATGACGAATATCTCCACTTCCACCACCGGATGCCGCCCGCGCGCGTGCGCTTGGTGGAGGTGGGCGGAGACGTGCAGCTGCATTCAGTGAAGATCTTCTAAGCAAGGACCCAAGGGCGTGGCGGGTAGGGGTGGGGGTGTAGGATCGCAGAGGAGGGTTTTGGATGGCGAATAAAGTGTAGCTGTAGTTCTG

（2）分別合成3個不同位置galectin-7CDNA的正義和反義發(fā)夾DNA。

（3）將正義和反義序列退火，并通過連接酶與基因沉默載體p-silencer5.1連接。

（4）通過酶切確定沉默載體構(gòu)建完成

（5）通過細(xì)胞培養(yǎng)和基因沉默載體轉(zhuǎn)染，檢測不同發(fā)夾的基因沉默效率

基因沉默效率細(xì)胞水平上的Western檢測

（6）選擇沉默效果高的發(fā)夾，通過核基因注射把p-silencer5.1中的啟動子和發(fā)夾基因轉(zhuǎn)入小鼠的核基因（7）首建鼠仔代基因鑒定，利用PCR引物鑒定發(fā)夾基因是否轉(zhuǎn)入。

基因沉默首建鼠PCR檢測

上游引物5’ATCCTCCCTTTATCCAGC 3’

下游引物 5’ GAGGGCCTATTTCCCATG 3’

退火溫度51度，產(chǎn)物大小392 BP

（8）首建鼠仔代Western Blot鑒定基因的沉默效果。

沉默鼠Western Blot檢測

一、疾病概述

眾所周知，哮喘等過敏性疾病都具有復(fù)雜的病因，是環(huán)境和遺傳共同作用的結(jié)果。長期外來刺激影響下，誘導(dǎo)患者某些基因的表達(dá)發(fā)生改變，引發(fā)支氣管上皮細(xì)胞異常損傷，然后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，最后導(dǎo)致氣道慢性炎癥和哮喘的發(fā)生[7-11]。這些外來刺激包括環(huán)境煙霧、大氣污染物、吸入變應(yīng)原（如屋塵螨）、化學(xué)刺激物、病毒等。在相同的外界刺激下，如即使是在空氣嚴(yán)重污染的重工業(yè)城市，也是只有少部分人發(fā)展成為哮喘患者，這就說明個人的遺傳基礎(chǔ)，即內(nèi)因（哮喘易感性）是哮喘發(fā)生的關(guān)鍵因素。目前認(rèn)為哮喘是一種有明顯家族聚集傾向的多基因遺傳性疾病，即哮喘的發(fā)生有患者的遺傳基礎(chǔ)。哮喘患者親屬發(fā)病率高于群體平均發(fā)病率。通過對比家族群間的遺傳差異可以篩選出哮喘易感候選基因，為哮喘的早期預(yù)防和治療提供依據(jù)。

二、模型背景

1、造模因素信息

半乳糖凝集素（galectin) 是凝集素超級家族中的一個家族，廣泛分布于各種活性有機(jī)體內(nèi)。已克隆并命名的成員有15個，結(jié)構(gòu)上都有1或2個糖識別域，對β半乳糖苷有特殊的親和力。半乳糖凝集素家族在細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等許多生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用。半乳糖凝集素-7是由Madsen及其同事在研究維持人正常表皮細(xì)胞表型的標(biāo)記時發(fā)現(xiàn)的。Galectin-7其相對分子量大小為14kD。Galectin-7還叫抑癌基因p53誘導(dǎo)基因1(P53-induced gene 1,PIG1)，主要表達(dá)在上皮細(xì)胞，特別是在復(fù)層上皮細(xì)胞，與細(xì)胞P53依賴性的凋亡，增殖，調(diào)控和分化有關(guān)。Francoise等的關(guān)于紫外線輻射（UVB）對表皮角質(zhì)形成細(xì)胞Galectin-7表達(dá)可能產(chǎn)生的影響的研究顯示UVB照射角質(zhì)形成細(xì)胞后，Galectin-7的 mRNA和蛋白表達(dá)量迅速增加。表明Galectin-7的過表達(dá)與曬傷或角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡相關(guān)。曹等的研究表明Galectin-7在維持表皮穩(wěn)態(tài)過程中至關(guān)重要。Niiyama等的研究證明在皮膚屏障破壞后，如特應(yīng)性皮炎（AD）、老年性干燥癥，表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞中Galectin-7的表達(dá)增加。且隨著AD患者皮膚損傷程度的減輕，同時觀察到角質(zhì)層膠帶剝離標(biāo)本中Galectin-7的值降低。因此他們把Galectin-7作為判斷皮膚狀況的生物標(biāo)志物。綜上所述，Galectin-7是維持上皮穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，而且其高表達(dá)與上皮屏障受損直接相關(guān)。

2、實驗動物背景信息

BALB/c Mouse

3、研究背景

該動物模型的研究目的及意義；該動物模型的國內(nèi)外研究進(jìn)展并附參考文獻(xiàn)。

目前哮喘的相關(guān)基因研究眾多。Jun Kanazawa等人對2組獨立的日本人群進(jìn)行了候選基因關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)鈣粘蛋白相關(guān)家族成員3（CDHR3）編碼區(qū)的SNP突變（rs6967330，Cys529 / Tyr）會增加呼吸道病毒感染的遺傳易感性，促進(jìn)哮喘的發(fā)生[1]。Toll樣受體（Toll-likereceptor，TLR）是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵部分。 TLR基因的變異與自身免疫性疾病，如過敏和哮喘有關(guān)。Petri Koponen等人分析了平均年齡為6.4歲的因支氣管炎住院的133名兒童的TLR基因在1rs5743618，TLR2rs5743708和TLR6rs5743810三個座位的單核苷酸多態(tài)性。他們研究首次證明了TLR1的rs5743618座位基因變異與幼童的細(xì)支氣管炎、哮喘以及濕疹的發(fā)生有關(guān) [2]。Yu Utsumi等人招募了182名日本哮喘患者，并對受試者進(jìn)行rs20541座位基因型分析。他們的結(jié)果顯示IL-13基因rs20541位點的3組不同基因型的患者之間氣道高反應(yīng)性、FEV1％的預(yù)測值以及FEF75％的預(yù)測值存在顯著差異，由此推測 IL-13基因中的rs20541多態(tài)性影響了該研究人群的氣道高反應(yīng)性和肺功能 [3]。綜上所述，以上研究都證實了哮喘患者的遺傳異質(zhì)性[12]。

我們的前期研究已經(jīng)證實哮喘患兒與非哮喘健康對照兒童比較支氣管上皮細(xì)胞在呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）感染后，半乳糖凝集素-7（galectin-7）基因上調(diào)8倍[5]。孫麗華等人也發(fā)現(xiàn)哮喘組急性發(fā)作期和緩解期血清galectin-7水平顯著高于健康對照組[6]。但是哮喘的發(fā)生機(jī)制研究中還沒有關(guān)于galectin-7基因的報道。1995年Madsen及其同事在研究維持人正常表皮細(xì)胞表型的標(biāo)記物時首次發(fā)現(xiàn)了半乳糖凝集素-7（galectin-7，GAL-7）[7]。Galectin-7還叫抑癌基因p53誘導(dǎo)基因1(P53-induced gene 1,PIG1)，主要表達(dá)在上皮細(xì)胞，特別是在復(fù)層上皮細(xì)胞，與細(xì)胞P53依賴性的凋亡，增殖，調(diào)控和分化有關(guān)。之后越來越多的研究發(fā)現(xiàn)galectin-7不僅影響腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，在生理發(fā)育、免疫、炎癥和代謝方面也有重要作用[8-15]。我們制作基因galectin-7沉默模型和該基因高表達(dá)模型，人為將該基因的表達(dá)提高或降低，從而探索該基因的表達(dá)水平的變化對氣道屏障的作用及其與哮喘發(fā)生的關(guān)系。

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