本課題組采用7日齡ICR乳鼠、經(jīng)灌胃CA10病毒的感染途徑，成功獲得CA10病毒灌胃感染小鼠模型。模型建立過程中采用臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)感染后動(dòng)物的臨床癥狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，并記錄死亡率和體重情況；采用熒光定量PCR-標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)感染后動(dòng)物血液和組織中的病毒載量進(jìn)行測(cè)定，以確定病毒的復(fù)制情況；采用HE染色法對(duì)組織切片進(jìn)行病理觀察，確定組織病變情況。

本CA10病毒灌胃感染小鼠模型與文獻(xiàn)報(bào)道的泰山醫(yī)學(xué)院的史衛(wèi)峰教授課題組的ICR乳鼠肌肉注射感染模型，都采用國際通用的封閉群ICR小鼠的乳鼠作為感染對(duì)象，都得到了具有典型神經(jīng)系統(tǒng)病癥的小鼠感染重癥模型。在感染5天后動(dòng)物出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，包括駝背或炸毛，后肢無力，單后肢癱瘓，雙后肢癱瘓，第7天觀察到動(dòng)物死亡；之后幾日臨床評(píng)分不斷升高，最終大部分感染小鼠死亡（觀察期結(jié)束時(shí)死亡率為80%）。采集感染小鼠的血液和后肢肌肉組織樣本，檢測(cè)到病毒載量從第1天的低于檢測(cè)水平（<200 copies/ul）上升到第3天的高水平（>106 copies/μl），說明病毒在機(jī)體內(nèi)的大量復(fù)制擴(kuò)增；尤其是在肌肉組織中病毒載量的結(jié)果與臨床癥狀相吻合。采集感染小鼠第5天心、肝、脾、肺、腎、小腸、胸腺、腦組織，檢測(cè)病毒載量在檢測(cè)閾值之上，說明除了肌肉組織CA10病毒也能在其他組織中進(jìn)行復(fù)制，并在脾臟、胸腺和腦組織中觀察到了相應(yīng)病變；尤其腦組織中的病變與重癥患者的腦炎癥狀接近。

本模型與文獻(xiàn)模型的不同之處在于：使用的病毒株不同，來自于不同病人的臨床分離株；小鼠的日齡不同，我們使用7日齡的ICR乳鼠，相對(duì)于5日齡小鼠更易于操作；感染途徑不同，我們采用灌胃感染的方式，而非采用肌肉注射感染方式，更接近于病毒糞口傳播的自然感染途徑，有利于觀察和研究CA10病毒的自然感染機(jī)制、嗜肌性以及對(duì)其他組織的損傷。

CA10病毒灌胃感染模型的建立需要確定乳鼠的日齡和感染的劑量。由于CA10病毒對(duì)5歲以下兒童易感，相應(yīng)的CA10病毒也只能使乳鼠在感染后表現(xiàn)出癥狀。我們?cè)囼?yàn)了7日齡和10日齡的乳鼠，發(fā)現(xiàn)10日齡乳鼠感染后癥狀表現(xiàn)不穩(wěn)定，因此選取了7日齡乳鼠作為感染動(dòng)物。對(duì)于病毒感染劑量，我們也嘗試了106、107、108 TCID50，選擇了癥狀更為合適和穩(wěn)定的107 TCID50。

由于CA10病毒主要通過糞口傳播，在自然感染狀態(tài)下是經(jīng)胃腸道侵入機(jī)體的，因此通過灌胃感染途徑得到的動(dòng)物模型更接近于疾病自然發(fā)生的狀態(tài)。課題組在原有CA1小鼠腹腔注射感染模型的基礎(chǔ)上，通過灌胃方式建立的小鼠感染模型，為研究病毒的感染機(jī)制和機(jī)體免疫反應(yīng)提供研究基礎(chǔ)，也完善了應(yīng)用于藥物和疫苗開發(fā)實(shí)驗(yàn)的模型種類。

CA10病毒在人間傳染病名錄中屬于第三類，涉及的實(shí)驗(yàn)需在BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室開展。CA10病毒已經(jīng)過風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，具有相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

CA10病毒對(duì)5歲以下兒童易感，主要通過糞口傳播，對(duì)于具有BSL-2防護(hù)裝備的實(shí)驗(yàn)人員危害較?。粚?shí)驗(yàn)人員均經(jīng)過生物安全培訓(xùn)獲得證書；進(jìn)入動(dòng)物房之前，穿戴防護(hù)服、口罩、帽子、鞋套，防護(hù)眼鏡等進(jìn)行防護(hù)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按要求去除防護(hù)設(shè)備集中處理。

成年ICR小鼠對(duì)CA10病毒不敏感，21日齡ICR小鼠在感染大劑量病毒后仍能自愈。對(duì)于感染動(dòng)物的排泄物進(jìn)行檢測(cè)，在少數(shù)糞便樣本中檢測(cè)到少量病毒，載量約為2X102~103copies/mg；因此需對(duì)墊料等接觸動(dòng)物糞便的物品按要求進(jìn)行高壓滅菌處理。

動(dòng)物感染病毒后取得的血液和組織直接放入核酸裂解液或組織固定液，滅活病毒。所有涉及到的相關(guān)污染物如離心管、灌胃針、手術(shù)剪、手術(shù)鑷和毒株等將統(tǒng)一高溫高壓消毒后集中處理。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在ABSL-2動(dòng)物房的生物安全柜中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)后將病毒毒株、動(dòng)物尸體、尿墊等包裝好進(jìn)行高壓滅菌處理，注射器放入利器桶處理。

1. 臨床癥狀表型：

7日齡ICR小鼠感染CA10病毒5天后，開始出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，癥狀由輕到重包括：駝背或炸毛，后肢無力，單后肢癱瘓，雙后肢癱瘓，嚴(yán)重的直至死亡。第7天感染小鼠出現(xiàn)死亡，此后臨床癥狀評(píng)分持續(xù)升高，持續(xù)出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象。到觀察期結(jié)束（感染后12天）時(shí)平均臨床評(píng)分為4分，存活率為20%（圖1A，1B）。不過，感染小鼠體重增加未出現(xiàn)顯著減緩，尤其是前10天基本與正常小鼠一致（圖1C）。

圖1. ICR 7日齡乳鼠灌胃感染CA10病毒后癥狀觀察。A，感染后乳鼠的存活率時(shí)間變化曲線； B，感染后乳鼠的臨床癥狀評(píng)分時(shí)間變化曲線； C，感染后乳鼠體重隨時(shí)間變化曲線。

2. 血液和組織中病毒復(fù)制情況：

感染后第1天血液和肌肉組織中病毒載量都低于檢測(cè)閾值。到第3天血液中病毒載量均值達(dá)到4.6 X 106 copies/μl，第5天時(shí)則下降至4X105copies/μl（圖2A）。后肢肌肉的病毒載量在感染后第3天為1.9X107 copies/mg，第5天繼續(xù)上升至1.1X108 copies/mg（圖2B）。除肌肉組織外，在其他組織樣本中也都能檢測(cè)到CA10病毒RNA，其中肝臟中的病毒載量最高，最高值可達(dá)105 copies/mg（圖2C）。心臟、腎臟、小腸和大腦中的病毒載量都超過了104 copies/mg；脾臟、肺和胸腺病毒復(fù)制比較少，都低于104 copies/mg。

圖2. ICR 7日齡乳鼠灌胃感染CA10病毒后血液和組織中病毒載量情況。A，感染后第3天和第5天血液中病毒載量情況； B，感染后第3天和第5天后肢肌肉組織中病毒載量情況；C，感染后第5天心、肝、脾、肺、腎、小腸、胸腺和腦組織中病毒載量情況。

3. 病理變化情況：

CA10病毒具有明顯的嗜肌性，感染小鼠后肢肌肉中的病毒載量最高，且感染后的臨床癥狀也表現(xiàn)為后肢的癱瘓癥狀，病理結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：骨骼肌病理損傷嚴(yán)重，具體表現(xiàn)為骨骼肌細(xì)胞變性壞死、大量炎細(xì)胞浸潤（圖3A）。除后肢肌肉外，在脾臟、胸腺和腦組織中也能觀察到明顯的病理變化：脾臟中能觀察到白髓萎縮，伴有巨噬細(xì)胞吞噬凋亡淋巴細(xì)胞形成的星空現(xiàn)象（圖3B）；胸腺組織切片出現(xiàn)皮質(zhì)變薄，淋巴細(xì)胞凋亡及壞死等病理損傷（圖3C）；腦組織局部神經(jīng)元周五和網(wǎng)狀神經(jīng)氈可見空泡，少數(shù)神經(jīng)元發(fā)生固縮現(xiàn)象（圖3D）。其他組織，包括心臟、肝臟、肺、腎、小腸組織均未見明顯病理損傷。

圖3. ICR7日齡乳鼠感染CA10病毒后組織病理變化情況。A-D，感染后第5天后肢骨骼肌、脾臟、胸腺、腦組織病理切片情況； E-H，正常小鼠的后肢骨骼肌、脾臟、胸腺、腦組織正常對(duì)照。（HE染色，A&E標(biāo)尺=100μm，B-D&F-H標(biāo)尺=200μm）

（一）模型評(píng)價(jià)方法：

1. 臨床癥狀觀察：

動(dòng)物感染CA10病毒后觀察10天，每天記錄體重變化、癥狀和死亡率。根據(jù)癥狀嚴(yán)重程度，參照以下標(biāo)準(zhǔn)低動(dòng)物進(jìn)行臨床評(píng)分打分：

0：未見異常；

1：駝背或炸毛；

2：后肢遲緩無力；

3：?jiǎn)魏笾c瘓；

4：雙后肢癱瘓；

5：死亡。

2. CA10病毒載量測(cè)定方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

2.1取樣：分別在感染后第1天、第3天、第5天處死動(dòng)物，采集血液100ul和后肢肌肉組織樣本50mg，感染第5天采集心、肝、脾、肺、腎、小腸、胸腺、腦組織，放入Trizol中；

2.2 RNA提?。翰捎肨rizol法提取血液和組織中的RNA；

2.3 一步法熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸濃度：

（1）特異性引物和Taqman探針：

Forwardprimer：GAAATGGRGTGTTGGAAACCA，

Reverseprimer：TTTCTGCGRAGTTGGACAAAG，

Probe:FAM-ATCAACCAYTTCTTCTCYCGCTCTGG-TAM；

（2）標(biāo)準(zhǔn)品：合成的CA10病毒核酸片段，濃度梯度為：2X109copies/μl、2X108copies/μl、2X107copies/μl、2X106copies/μl、2X105copies/μl、2X104copies/μl、2X103copies/μl、2X102copies/μl。共8個(gè)稀釋梯度，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。

（3）陰性對(duì)照和陽性對(duì)照：陰性對(duì)照用水代替核酸樣本；陽性對(duì)照采用CA10病毒儲(chǔ)液提取得到的核酸；

（4）熒光定量PCR試劑盒：Qiagen RNeasy Mini Kit（貨號(hào):74106），根據(jù)試劑盒要求準(zhǔn)備反應(yīng)體系；

（5）反應(yīng)條件：①反轉(zhuǎn)過程：50℃ 30min；②PCR過程：95℃ 15min；94℃ 15s，60℃ 60s，該步驟循環(huán)數(shù)為40；

（6）實(shí)驗(yàn)儀器：ABI Q3熒光定量PCR儀

（7）結(jié)果分析：①反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下條件，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。

陰性對(duì)照：無擴(kuò)增，為陰性。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2大于0.95可用，若低于0.95數(shù)據(jù)不可用，則需重新測(cè)定；

③結(jié)果判斷：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出CA10病毒的載量。病毒載量的檢測(cè)閾值為2X102 copies/μl，低于該數(shù)值的結(jié)果不可信。

3. 病理分析：HE染色

蘇木精—伊紅染色法（hematoxylin-eosin?staining，H&E）是石蠟切片中常用的染色方法：其中蘇木精染液呈堿性，可將嗜堿性的細(xì)胞核及細(xì)胞內(nèi)核糖體染成藍(lán)紫色；伊紅染液呈酸性，將嗜酸性的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)染成紅色。

ICR小鼠灌胃感染CA10病毒5天后，取后肢骨骼肌、心、肝、脾、肺、腎、小腸、胸腺、腦置于10%福爾馬林中固定72 h，經(jīng)梯度酒精脫水后將其包埋在石蠟中，切片得到的石蠟切片厚度為 5 μm，隨后進(jìn)行H&E染色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

（二）評(píng)價(jià)指標(biāo)：

1. 臨床癥狀評(píng)價(jià)：CA10病毒灌胃感染成功模型應(yīng)具有典型的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，即可觀察到動(dòng)物的重癥肌無力表型，包括單后肢或雙后肢癱瘓。根據(jù)臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在灌胃感染CA10病毒觀察期（12天）內(nèi)，第5天可觀察到臨床癥狀，且癥狀持續(xù)加重、評(píng)分持續(xù)升高；第7天出現(xiàn)死亡，但死亡率低于腹腔注射感染，后者在觀察期內(nèi)全部死亡。

2. 血液和組織中病毒復(fù)制情況評(píng)價(jià)體系：動(dòng)物在灌胃感染CA10病毒后第1天、第3天、第5天采集血液和后肢肌肉組織樣本，在第5天采集心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺組織，測(cè)定其中的病毒載量。經(jīng)灌胃感染CA10病毒后，第1天病毒載量都低于檢測(cè)閾值。CA10病毒首先在血液中復(fù)制達(dá)到較高水平，第3天的檢測(cè)值在106 copies/μl以上，而到第5天血液中病毒載量出現(xiàn)下降，檢測(cè)值在105 copies/μl水平；而在后肢肌肉組織中，CA10病毒載量由第3天的106~107 copies/mg上升到107~108 copies/mg，說明病毒在肌肉中發(fā)生了大量擴(kuò)增，具有典型的嗜肌性，與臨床癥狀表現(xiàn)相吻合。在其他組織中，病毒載量大部分在檢測(cè)閾值之上。

3. 病理評(píng)價(jià)體系：CA10病毒具有明顯的嗜肌性，灌胃感染小鼠后肢肌肉中的病毒載量最高，臨床癥狀也表現(xiàn)為后肢癱瘓，在病理結(jié)果上同樣可見骨骼肌病理損傷嚴(yán)重，骨骼肌細(xì)胞變性壞死、且出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤。除后肢肌肉外，在脾臟、胸腺和腦組織中也能觀察到明顯的病理變化，尤其是腦組織局部神經(jīng)元周五和網(wǎng)狀神經(jīng)氈可見空泡，少數(shù)神經(jīng)元發(fā)生固縮現(xiàn)象，說明在小鼠CA10灌胃感染模型中也能出現(xiàn)神經(jīng)性病變。

1.病毒準(zhǔn)備：CA10病毒(GenBank: MF688814.1)，由醫(yī)院咽拭子分離得到，在人橫紋肌瘤細(xì)胞（RD）中培養(yǎng)、擴(kuò)增，并采用反復(fù)凍融法釋放病毒，離心富集病毒。

（1）細(xì)胞病毒培養(yǎng)操作：

RD細(xì)胞經(jīng)常規(guī)傳代培養(yǎng)接種到T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至融合度約80%；感染前棄去原培養(yǎng)基，細(xì)胞用含2%雙抗的PBS洗2遍，吸出PBS后加入無血清DMEM培養(yǎng)基。接種適量的CA10病毒后，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育1~2h；之后棄去無血清培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。接種病毒后2~3d細(xì)胞病變CPE達(dá)到+++～++++，將T75細(xì)胞瓶置封口袋中，-80℃超低溫冰箱凍化3次。然后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，4℃ 2000rpm離心20min，沉淀細(xì)胞碎片。吸取病毒上清，分裝后凍存，并測(cè)定病毒滴度TICD50。

（2）組織病毒培養(yǎng)操作：

將CA10病毒以肌肉點(diǎn)注方式感染10日齡ICR乳鼠，三天后取肌肉組織置于適量PBS中研磨均勻，3000rpm離心30min，上清即為病毒液，分裝后置于-80℃冰箱保存。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：采用SPF級(jí)7日齡ICR小鼠乳鼠，母鼠自然哺乳，在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立飼養(yǎng)。CA10動(dòng)物模型建立實(shí)驗(yàn)通過IACUC審核，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求。

3.病毒感染：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的感染劑量，即107 TCID50 CA10病毒，將病毒經(jīng)灌胃途徑感染小鼠，感染劑量為100μl。對(duì)照組灌胃同等量的PBS。

一、疾病概述

手足口病是由多種腸道病毒引發(fā)的病毒性傳染病，主要傳播途徑是糞口傳播，多發(fā)于嬰幼兒以及5歲以下兒童。手足口病一般為自限性的，輕癥表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皰疹或斑丘疹，多數(shù)患兒一周左右自愈；但少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等重癥的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。個(gè)別重癥患兒病情發(fā)展快，可導(dǎo)致死亡。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種（型），主要由腸道病毒（enterovirus）、柯薩奇病毒（coxsakievirus）和埃可病毒（echovirus）組成。自2008年在新加坡的暴發(fā)流行，柯薩奇病毒A10型（CoxsackievirusA10，CA10）成為手足口病主要致病血清型之一，由其感染引起的手足口病爆發(fā)事件在法國、芬蘭、印度等國家和地區(qū)不斷被報(bào)道。在我國，2013年以前主要流行的手足口病病原以EV71和CA16為主，CA6和CA10次之；而在2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐漸上升，成為國內(nèi)手足口病感染的優(yōu)勢(shì)病原體之一。CA10共分為A～G的7個(gè)基因型，可根據(jù)各地流行株的序列信息進(jìn)行核苷酸和氨基酸的同源性對(duì)比，從而分析CA10的流行情況。在我國，CA10近年來在多地區(qū)流行的病毒株保持著較高的同源性，與其他國家的分離株之間的同源性距離較遠(yuǎn)，具有地域分布特點(diǎn)以及一定的時(shí)間分布特點(diǎn)。CA10傳染性強(qiáng)、隱性感染比例大、傳播途徑復(fù)雜、傳播速度快，在短時(shí)間內(nèi)可造成較大范圍的流行，疫情控制難度大。

CVA10屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，病毒直徑約30nm，衣殼包裹著單股正鏈RNA，無囊膜，呈正二十面體結(jié)構(gòu)。CA10病毒主要通過糞口途徑傳播，經(jīng)胃腸道進(jìn)入機(jī)體內(nèi)。病毒在入侵的局部上皮細(xì)胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴組織中繼續(xù)增殖并釋放入血導(dǎo)致第一次病毒血癥。病毒隨血液傳播接觸到正常靶細(xì)胞。病毒表面的VP1蛋白與靶細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，完成吸附過程，其基因組RNA進(jìn)入胞質(zhì)。之后，病毒以其正鏈RNA作為模板，合成互補(bǔ)的負(fù)鏈RNA，又以負(fù)鏈RNA為模板合成病毒正鏈RNA，從而得到大量病毒RNA，進(jìn)入子代病毒顆粒組裝階段。通過轉(zhuǎn)錄、翻譯，復(fù)制出二代病毒，再次釋放入血形成第二次病毒血癥并引起臨床癥狀。目前有大量研究表明，手足口病患兒的細(xì)胞免疫出現(xiàn)紊亂，并且這種免疫紊亂在重癥與死亡病例中表現(xiàn)得更加嚴(yán)重。肺水腫被認(rèn)為是感染的患兒中是最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，腦干的損傷則被認(rèn)為是導(dǎo)致肺水腫的重要因素。很多研究表明參與細(xì)胞免疫的諸多炎性因子，例如IL-1、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α的增加、T細(xì)胞亞群CD3+CD4+，以及自然殺傷細(xì)胞（NK）等，與肺水腫的發(fā)生具有相關(guān)性。

CA10易感染5歲以下年齡的幼兒，潛伏期多為2-10天。CA10感染兒童多引起輕型手足口病、皰疹性咽峽炎等，患兒往往無明顯的早期癥狀，大多數(shù)病人預(yù)后良好。臨床上，往往表現(xiàn)為多發(fā)的斑丘疹和（或）皰疹，最多見于手足口、臂及膝關(guān)節(jié)。典型皰疹通常突出皮膚表面，呈現(xiàn)黃豆粒大小，圓形或橢圓形，其內(nèi)液體混濁，常無疼痛和瘙癢感，約1周時(shí)間皰疹可自行消退，通常不留疤痕。病人或伴有發(fā)熱、流涕、咳嗽、食欲不振、惡心、嘔吐或腹瀉等癥狀，一般能自愈，無后遺癥。但少數(shù)兒童感染CA10后出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹和神經(jīng)呼吸綜合征等。

由于CA10病毒主要通過糞口傳播，在自然感染狀態(tài)下是經(jīng)胃腸道侵入機(jī)體的，因此通過灌胃感染途徑得到的動(dòng)物模型更接近于疾病自然發(fā)生的狀態(tài)。課題組在原有CA10小鼠腹腔注射感染模型的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究了通過灌胃方式建立的小鼠感染模型，為研究病毒的感染機(jī)制和機(jī)體免疫反應(yīng)提供研究基礎(chǔ)，也可用于藥物和疫苗開發(fā)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

二、模型背景

1、CA10病毒信息

CA10病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是柯薩奇病毒A組成員，病毒呈對(duì)稱二十面球體結(jié)構(gòu)，無囊膜，由蛋白外殼和核酸組成，其核酸為單股正鏈RNA。CA10病毒基因組為單股正鏈RNA，全長約7.4 kb。CA10基因組兩端為保守的非編碼區(qū)，中間為一個(gè)獨(dú)立連續(xù)的開放閱讀框架（ORF）?；蚪M的順序依次為5'端非編碼區(qū)，P1區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)和一段3'端非編碼區(qū)。5’端共價(jià)結(jié)合小分子蛋白質(zhì)Vpg（約7kDa），與病毒RNA合成和基因組裝配有關(guān)；3’端帶有polyA尾。P1 區(qū)編碼4 種衣殼蛋白VP1 ~VP4，VP1 ~ VP3 在病毒表面，VP4 包裹在感染病毒的內(nèi)部，這4種衣殼蛋白均具有抗原活性；P2 和P3 區(qū)編碼7 種非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D，與病毒RNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，病毒多聚蛋白的剪切、病毒顆粒的裝配等功能相關(guān)。CA10病毒可在RD細(xì)胞中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 37℃，48~96h達(dá)到復(fù)制高峰；病毒在宿主細(xì)胞漿內(nèi)增殖，迅速引起細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓脫落，最后病毒顆粒破膜釋放。CA10病毒的感染可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體，具有中和作用，能夠抵抗病毒的再次感染。2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐漸上升，成為國內(nèi)手足口病感染的優(yōu)勢(shì)病原體之一。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

ICR小鼠毛色白化。適應(yīng)性強(qiáng)，體格健壯，繁殖力強(qiáng)，生長速度快，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好，雌鼠自發(fā)性畸胎瘤和管狀腺瘤發(fā)病率為0%~1%，用氨基甲酸乙酯誘發(fā)時(shí)，11~16天胚胎期畸胎瘤和管狀腺瘤發(fā)病率為5.9%，離乳個(gè)體管狀腺瘤和囊瘤發(fā)生率為30%，孕鼠為3%。是國際通用的封閉群小鼠。外周血項(xiàng)和骨髓細(xì)胞，具有較好的穩(wěn)定性，是良好的血液學(xué)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物。10日齡以內(nèi)的ICR乳鼠對(duì)手足口病原較為敏感，由于CA10病毒具有嗜肌性，乳鼠感染后常表現(xiàn)出豎毛、單肢癱瘓、雙肢癱瘓、甚至死亡的病癥，是進(jìn)行是手足口病原研究的理想動(dòng)物。

3、研究背景

隨著CA10流行程度的增加、重癥病例的出現(xiàn)，開發(fā)針對(duì)性的抗病毒藥物和疫苗成為當(dāng)務(wù)之急；肌肉注射感染和腹腔注射途徑的感染與CA10病毒糞口傳播的自然感染方式存在一定的差距，因此有必要建立穩(wěn)定的CA10病毒灌胃感染動(dòng)物模型，不僅可以用于研究病毒自然感染機(jī)制和機(jī)體免疫反應(yīng)，也補(bǔ)充了藥物和疫苗研發(fā)和驗(yàn)證的關(guān)鍵模型。

目前國內(nèi)的CA10病毒動(dòng)物感染模型有泰山醫(yī)學(xué)院的史衛(wèi)峰教授課題組的ICR乳鼠感染模型，采用5日齡ICR乳鼠感染CA10細(xì)胞適應(yīng)株TA151R，感染劑量為1.5X103TCID50，感染途徑為肌肉注射（Protective Efficacies ofFormaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine and Antivirals in a Murine Modelof Coxsackievirus A10 Infection. Journal of Viology, 2017, Volume 91, Issue 13:e00333-17.）。

本課題組已建立的CA10病毒動(dòng)物感染模型采用腹腔注射途徑，對(duì)7日齡ICR乳鼠感染104 TCID50 CA10病毒。感染4天后，感染小鼠的臨床癥狀由輕到重包括：駝背或炸毛，后肢無力，單后肢癱瘓，雙后肢癱瘓，嚴(yán)重的直至死亡。感染后第5天，感染小鼠臨床癥狀評(píng)分超過4分；感染后第7天，感染小鼠全部死亡。同時(shí)，相對(duì)于正常組小鼠，感染小鼠體重增加減緩。檢測(cè)感染小鼠血液和后肢肌肉中病毒載量發(fā)現(xiàn)：第3天血液中病毒載量到達(dá)高水平1.7X107 copies/μl，隨后下降至1.1X105copies/μl；后肢肌肉的病毒載量在第3天和第5天都維持很高的水平，分別為2.9X107 copies/mg和6.1X107 copies/mg。