Nipsnap1基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術(shù)的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個(gè)總要的外顯子功能區(qū)敲除掉，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。Armh4基因敲除小鼠模型為完全性基因敲除模型（KO），該模型應(yīng)用范圍廣，可以制造針對各類疾病不同組織器官細(xì)胞的疾病模型。

CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其對基因進(jìn)行定位的精準(zhǔn)編輯，在向?qū)NA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細(xì)胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準(zhǔn)確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個(gè)條件。第一，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對保守的PAM序列（NGG）。第二，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)?？諝饨?jīng)過初、中、三級(jí)過濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

Nipsnap1缺失小鼠鑒定結(jié)果圖：

圖1.Nipsnap1缺失小鼠鑒定結(jié)果。

通過送測序，鑒定。雜合子：一條缺失8bp，為雙峰；純和子：兩條缺失8bp，為單峰。

1.guideRNA設(shè)計(jì)

guideRNA信息:

Nipsnap1（ko） -sgRNA1： CCACAAGGTGGATCCTCGGAAGG

Nipsnap1（ko） -sgRNA1： CAACGTGAAGCCCGAATGTCTGG

一、疾病概述

肺結(jié)核（Pulmonary tuberculosis，PTB）是世界高死亡率的嚴(yán)重傳染病之一。PTB是由各種分支桿菌菌株引起的，結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）大多在人類中觀察到。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（世衛(wèi)組織）的報(bào)告，2017年全世界有1000萬新病例PTB疾病和150萬例死亡（世衛(wèi)組織，2018年）。 據(jù)估計(jì)，世界人口的三分之一是潛伏性感染的Mtb，其中5%至10%會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。

主要癥狀為有較密切的結(jié)核病接觸史，起病可急可緩，多為低熱（午后為著）、盜汗、乏力、納差、消瘦、女性月經(jīng)失調(diào)等；呼吸道癥狀有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸悶或呼吸困難。肺部體征依病情輕重、病變范圍不同而有差異，早期、小范圍的結(jié)核不易查到陽性體征，病變范圍較廣者叩診呈濁音，語顫增強(qiáng)，肺泡呼吸音低和濕啰音。晚期結(jié)核形成纖維化，局部收縮使胸膜塌陷和縱隔移位。在結(jié)核性胸膜炎者早期有胸膜摩擦音，形成大量胸腔積液時(shí)，胸壁飽滿，叩診濁實(shí)，語顫和呼吸音減低或消失。 盡管有微生物治療，多達(dá)一半的結(jié)核病幸存者仍具有某種形式的持續(xù)性肺功能障礙。肺功能障礙，從輕微異常到嚴(yán)重氣喘，可增加呼吸道原因死亡的風(fēng)險(xiǎn)?？焖僭\斷和有效治療對于控制PTB的傳播和降低其死亡率非常重要。盡管對PTB的機(jī)理研究開展了了大量工作，但PTB進(jìn)展中的分子機(jī)制仍然不清楚。二、模型背景1、Nipsnap1基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號(hào)）：18082? 敲除基因NCBI網(wǎng)址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/18082? 敲除基因名稱：Nipsnap1? 敲除基因Ensembl網(wǎng)址鏈接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000034285;r=11:4873951-4894200? 方案針對的轉(zhuǎn)錄本（Ensembl號(hào)）：ENSMUSG000000342852、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息所采用的小鼠品系為C57BL/6。來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個(gè)亞系。1985年從Olac引到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達(dá)20%。③對放射物質(zhì)耐受力中等;補(bǔ)體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對結(jié)核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產(chǎn)量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質(zhì)濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。3、研究背景 迄今已鑒定4個(gè)NIPSNAP家族蛋白：NIPSNAP-1和-2以及NIPSNAP-3和-4。NIPSNAP家族蛋白含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：4-硝基苯磷酸酶域和非神經(jīng)性SNAP25類蛋白質(zhì)同源結(jié)構(gòu)域。研究主要涉及癲癇發(fā)作，苯基酮尿癥，和阿爾茨海默病等。NIPSNAP-1在大腦中的高水平上表達(dá)，肝臟和腎臟(1-3)。比對多個(gè)物種的NIPSNAP家族基因序列，揭示了NIPSNAP家族基因序列的高度保守性，提示其關(guān)鍵生物學(xué)功能。 NIPSNAP-1可局部化到外線粒體膜和內(nèi)膜空間，并與細(xì)胞索蛋白（如P62/SQSTM-1和ATG8s(4)相互作用。因此，NIPSNAP-1可充當(dāng)支架蛋白，在先天免疫反應(yīng)期間在線粒體相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。與炎癥相關(guān)的慢性疼痛是一個(gè)重要的臨床問題，其基本機(jī)制仍然缺乏理解。NIPSNAPs表達(dá)的變化可能有助于炎癥性疼痛的發(fā)病機(jī)制(5)。 研究表明線粒體蛋白NIPSNAP -1和-2和長鏈acyl-CoA脫氫酶（VLCAD）作為抗生素clarithromycin結(jié)合蛋白。在人類上皮細(xì)胞系BEAS-2B和T24中，由脂質(zhì)多糖和Pam3-CSK4誘導(dǎo)的致炎細(xì)胞因子（IL-8和IL-6）的產(chǎn)生被NIPSNAP-1或-2 的所抑制。此外，在各種細(xì)胞系中敲除NIPSNAP-1抑制了IL-8和IL-6 mRNA和NF-βB活性的LPS誘導(dǎo)表達(dá)(6)。參考文獻(xiàn)：1. Nautiyal M, Sweatt AJ, MacKenzie JA, Mark Payne R, Szucs S, Matalon R, Wallin R, Hutson SM. Neuronal localization of the mitochondrial protein NIPSNAP1 in rat nervous system. Eur J Neurosci. 2010 Aug;32:560-9.2. Seroussi E, Pan HQ, Kedra D, Roe BA, Dumanski JP. Characterization of the human NIPSNAP1 gene from 22q12: a member of a novel gene family. Gene. 1998 May 28;212:13-20.3. Schoeber JP, Topala CN, Lee KP, Lambers TT, Ricard G, van der Kemp AW, Huynen MA, Hoenderop JG, Bindels RJ. Identification of Nipsnap1 as a novel auxiliary protein inhibiting TRPV6 activity. Pflugers Arch. 2008 Oct;457:91-101.4. Behrends C, Sowa ME, Gygi SP, Harper JW. Network organization of the human autophagy system. Nature. 2010 Jul 1;466:68-76.5. Okuda-Ashitaka E, Minami T, Tsubouchi S, Kiyonari H, Iwamatsu A, Noda T, Handa H, Ito S. Identification of NIPSNAP1 as a nocistatin-interacting protein involving pain transmission. J Biol Chem. 2012 Mar 23;287:10403-13.6. Yamamoto S, Ogasawara N, Yamamoto K, Uemura C, Takaya Y, Shiraishi T, Sato T, Hashimoto S, Tsutsumi H, et al. Mitochondrial proteins NIP-SNAP-1 and -2 are a target for the immunomodulatory activity of clarithromycin, which involves NF-kappaB-mediated cytokine production. Biochem Biophys Res Commun. 2017 Feb 12;483:911-6.