Nap1l5敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術(shù)的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個(gè)總要的外顯子功能區(qū)敲除掉，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。

CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其對(duì)基因進(jìn)行定位的精準(zhǔn)編輯，在向?qū)NA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細(xì)胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準(zhǔn)確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個(gè)條件。第一，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（NGG）。第二，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。

NAP1L5(Nucleosome Assembly Protein 1 Like 5)是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與NAP1L5相關(guān)的疾病包括Beckwith-Wiedemann綜合征。其主要在兒童發(fā)育時(shí)期發(fā)揮功能，引起一些疾病，而對(duì)于該基因在人類衰老階段是否會(huì)在心腦血管疾病中發(fā)揮功能卻鮮有研究，該研究為Nap1l5的研究提供了新的方向與思路。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)?？諝饨?jīng)過(guò)初、中、三級(jí)過(guò)濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長(zhǎng)、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

因現(xiàn)階段小鼠模型仍處于繁育階段，所以相關(guān)實(shí)驗(yàn)主要集中在細(xì)胞上。

為了探究Nap1l5在心肌肥厚中的功能，我們首先檢測(cè)了PE誘導(dǎo)的肥厚的心肌細(xì)胞中的Nap1l5中的mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Nap1l5在PE誘導(dǎo)的肥厚的心肌細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)（圖1A），同時(shí)發(fā)現(xiàn)在TAC術(shù)后的心肌肥厚模型中Napll5的表達(dá)同樣顯著上調(diào)（圖1B），說(shuō)明Nap1l5在心肌肥厚的發(fā)生中可能發(fā)揮重要功能。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Nap1l5在心肌肥厚中的功能，我們通過(guò)siRNA對(duì)心肌細(xì)胞中的Nap1l5進(jìn)行了敲低，圖1C為敲低水平的檢測(cè)，證明siNap1l5能夠顯著敲低Nap1l5的表達(dá)；敲低Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp在心肌細(xì)胞中的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯受到了抑制，而Myh6卻明顯上調(diào)（圖1D）；而Nap1l5的過(guò)表達(dá)正好有相反的結(jié)果（圖1F），說(shuō)明Nap1l5在體外確實(shí)可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的肥厚。

總之，研究結(jié)果表明，敲低Nap1l5可以緩解心肌肥厚的發(fā)生，而過(guò)表達(dá)Nap1l5可以促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生。

圖1. Nap1l5 可以促進(jìn)心肌肥厚。（A、B）Nap1l5及心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp、Myh7和Myh6在PE處理的心肌細(xì)胞及心臟TAC模型中的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；（C）Nap1l5敲低水平檢測(cè)；（D）敲低Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp、Myh6在心肌細(xì)胞中的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；（E）過(guò)表達(dá)Nap1l5的水平檢測(cè)；（F）過(guò)表達(dá)Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp、Myh6在心肌細(xì)胞中的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；*P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs Control（A）、Sham（B）、siNeg（C、D）、AdEGFP（E、F），P < 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001 vs Control組。

鑒定結(jié)果解讀：

Ⅰ. 65#, 67#, 72#, 80#, 81#純合；

Ⅱ. 57#, 77#野生型；

1 項(xiàng)目策略圖

2 項(xiàng)目策略概述 利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)，設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄 gRNA，將 Cas9、 gRNA 同時(shí)注射到小鼠的受精卵中。Cas9 蛋白在 gRNA 引導(dǎo)下結(jié)合到靶位點(diǎn)進(jìn)而造成 DNA 雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)堿基序列缺失，實(shí)現(xiàn)基因敲除。

3 gRNA 序列信息

4.構(gòu)建PE誘導(dǎo)的心肌肥大細(xì)胞模型，檢測(cè)ArmH4過(guò)表達(dá)以及敲低后心肌肥厚分子標(biāo)志物水平，分別提取總RNA，將內(nèi)源性GAPDH的mRNA含量設(shè)為對(duì)照，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)心肌肥厚指標(biāo)Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertuophic cardiomyopathy, HCM) 是一種器質(zhì)性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室和( 或) 右心室及室間隔不對(duì)稱肥厚、心室腔變小、心室順應(yīng)性降低。 病因：肥厚型心肌病是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發(fā)性，家族性病例和散發(fā)病例、兒童病例和成年病例具有同樣的致病基因突變。 臨床表現(xiàn)：1.以青壯年多見、常有家族史。 2.可以無(wú)癥狀，也可以有心悸、勞力性呼吸困難、心前區(qū)悶痛、易疲勞、暈厥甚至猝死，晚期出現(xiàn)左心衰的表現(xiàn)。 3.梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左緣可出現(xiàn)粗糙的收縮中晚期噴射性雜音，可伴震顫，應(yīng)用洋地黃制劑、硝酸甘油、靜點(diǎn)異丙腎上腺素及Valsalva動(dòng)作后雜音增強(qiáng)，反之應(yīng)用β受體阻滯劑、去甲腎上腺素、下蹲時(shí)雜音減弱。有些病人聞及S3及S4心音及心尖區(qū)相對(duì)性二尖瓣關(guān)閉不全的收縮期雜音。 臨床診斷：超聲心動(dòng)圖提示左心室壁或（和）室間隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血壓病、風(fēng)濕性心臟病二尖瓣病、先天性心臟病（房間隔、室間隔缺損）及代謝性疾病伴發(fā)心肌肥厚。二、模型背景1、Nap1l5基因信息? 敲除基因名稱（ NCBI 號(hào)）： Nap1l5（ 58243）敲除基因 NCBI 網(wǎng)址鏈接： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/58243敲除基因名稱（ MGI 號(hào)）： Nap1l5（ MGI: 1923555）敲除基因 Ensembl 網(wǎng)址鏈接：)，它們的印記狀態(tài)在人類和小鼠之間保存。在分子水平上，印跡基因由染色質(zhì)標(biāo)記的表觀遺傳標(biāo)記控制，包括DNA甲基化或抑制組蛋白修飾，以沉默一個(gè)親本等位基因，從而導(dǎo)致單等位基因表達(dá)[4]。父母的沖突或親屬關(guān)系理論提出的摩爾和黑格表明[5],在哺乳動(dòng)物中,父親一般地表達(dá)了印跡基因作用于胎盤促進(jìn)萃取母親提高后代的資源開發(fā)和健身,而母親般地印跡基因表達(dá)行為限制保護(hù)產(chǎn)婦胎兒生長(zhǎng)資源長(zhǎng)期母親的生殖健康。印跡基因還可以通過(guò)影響細(xì)胞增殖或凋亡直接作用于胎兒，也可以通過(guò)影響母體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)胎盤的通量來(lái)影響胎兒生長(zhǎng)。最近的證據(jù)也表明，印跡基因在認(rèn)知行為中的作用，因?yàn)楦赶当磉_(dá)的Peg3基因失活研究表明，小鼠缺乏母性照料，從父親那里遺傳了一個(gè)空等位基因的雌性小鼠，會(huì)導(dǎo)致泌乳能力減弱，無(wú)法養(yǎng)育幼鼠[6]。一些實(shí)驗(yàn)室的工作也表明，通過(guò)體細(xì)胞核移植克隆的動(dòng)物的不完全表觀遺傳重編程導(dǎo)致印跡基因的異常表達(dá)，可能導(dǎo)致胎盤腫大[7, 8]。對(duì)這類基因的初步研究突出了其在一般生長(zhǎng)發(fā)育中的重要作用[9]。最近，很明顯，這些基因也可能以一種高度特定的方式對(duì)大腦的發(fā)育和隨后的行為表型做出貢獻(xiàn)[10, 11]。 NAP1L5 (Nucleosome Assembly Protein 1 Like 5)是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與NAP1L5相關(guān)的疾病包括Beckwith-Wiedemann綜合征。該基因的一個(gè)重要同源基因是NAP1L1。可以影響身體的幾個(gè)部分。嬰兒和兒童在8歲之前通常都比正常身高要大，這時(shí)生長(zhǎng)速度減緩，導(dǎo)致成人的平均身高。身體的癥狀可能包括一方或地區(qū)越來(lái)越比另一邊(不對(duì)稱增長(zhǎng)或hemihyperplasia)、臍膨出或其他腹壁缺陷出生時(shí),低血糖(低血糖)在嬰兒期,異常大的舌頭(巨舌),異常大的腹部器官,折痕或坑附近的皮膚的耳朵,和腎臟異常。受影響的兒童罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)更高，尤其是一種罕見的腎癌——Wilms腫瘤，一種肌肉組織癌——橫紋肌肉瘤，以及一種肝癌——肝母細(xì)胞瘤。然而，Nap1L5是否會(huì)參與免疫反應(yīng)，影響炎癥作用，以及在結(jié)核病及心血管疾病中的功能及作用機(jī)制還有待我們進(jìn)一步探究。參考文獻(xiàn)：1. Mcgrath, J. and D. Solter, Completion Of Mouse Embryogenesis Requires Both the Maternal And Paternal Genomes. Cell, 1984. 37(1): p. 179-183.2. Monk, D., et al., Limited evolutionary conservation of imprinting in the human placenta. Proceedings Of the National Academy Of Sciences Of the United States Of America, 2006. 103(17): p. 6623-6628.3. Morison, I.M., J.P. Ramsay, and H.G. Spencer, A census of mammalian imprinting. Trends In Genetics, 2005. 21(8): p. 457-465.4. Lewis, A., et al., Imprinting on distal chromosome 7 in the placenta involves repressive histone methylation independent of DNA methylation. Nature Genetics, 2004. 36(12): p. 1291-1295.5. Moore, T. and D. Haig, Genomic Imprinting In Mammalian Development - a Parental Tug-Of-War. Trends In Genetics, 1991. 7(2): p. 45-49.6. Li, L.L., et al., Regulation of maternal behavior and offspring growth by paternally expressed Peg3. Science, 1999. 284(5412): p. 330-333.7. Mann, M.R.W., et al., Disruption of imprinted gene methylation and expression in cloned preimplantation stage mouse embryos. Biology Of Reproduction, 2003. 69(3): p. 902-914.8. Suemizu, H., et al., Expression profiling of placentomegaly associated with nuclear transplantation of mouse ES cells. Developmental Biology, 2003. 253(1): p. 36-53.9. Reik, W., et al., Imprinted genes and the coordination of fetal and postnatal growth in mammals. Novartis Found Symp, 2001. 237: p. 19-31; discussion 31-42.10. Davies, W., A.R. Isles, and L.S. Wilkinson, Imprinted genes and mental dysfunction. Ann Med, 2001. 33(6): p. 428-36.11. Isles, A.R. and L.S. Wilkinson, Imprinted genes, cognition and behaviour. Trends Cogn Sci, 2000. 4(8): p. 309-318.