該動物模型已在多種疾病中進(jìn)行了應(yīng)用，技術(shù)方法和指標(biāo)體系相對成熟，在流感病毒、柯薩奇病毒等急性病毒感染評價中應(yīng)用鮮有報(bào)道，我們的結(jié)果提示，該感染模型的研究對于CRP在急性病毒感染的致病機(jī)制評價以及以治療為目的的潛在靶向分子干預(yù)研究中將發(fā)揮積極作用。

CRP基因敲除小鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠在賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司模式動物研究中心完成，該中心具有符合國際標(biāo)準(zhǔn)的動物模型制備相關(guān)完備監(jiān)督管理制度。動物的繁殖及感染模型評估在中國疾控中心動物中心完成，所有操作在SFP級別下遵守二級生物安全管理規(guī)定進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動物尸體實(shí)行無害化處理，對生態(tài)環(huán)境無影響。

1、CRP基因敲除小鼠鑒定

采集鼠尾組織提取DNA，分別通過PCR和測序的方法對構(gòu)建的F1代和傳代CRP基因敲除小鼠進(jìn)行表型鑒定，結(jié)果顯示，CRP敲除小鼠能夠穩(wěn)定傳代。

圖1 CRP基因敲除小鼠PCR鑒定結(jié)果:（A）F1代純合子小鼠鑒定結(jié)果；（B）傳代小鼠3代以上純合子小鼠鑒定結(jié)果。

2、分別用甲型H1N1流感病毒2009大流行株、甲型H1N1小鼠適應(yīng)株P(guān)R8、人H7N9禽流感病毒、人H5N1禽流感病毒株、柯薩奇B3病毒感染CRP基因敲除鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠, 結(jié)果顯示，相對野生鼠，甲型H1N1流感病毒2009大流行株和H7N9禽流感病毒在CRP基因敲除鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因鼠中均表現(xiàn)更高的致病性和致死性，病毒在肺組織中有效復(fù)制，造成支氣管肺炎病理表現(xiàn)。而柯薩奇病毒B3在CRP基因敲除鼠較野生鼠沒有明顯的體重?fù)p失，而在人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠，其體重?fù)p失與野生鼠相似，但心肌炎病理改變更為明顯。人H5N1禽流感病毒和甲型H1N1小鼠適應(yīng)株P(guān)R8感染模型正在進(jìn)行中。

圖2 病毒感染CRP基因敲除小鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠體重和致死率變化。（A）甲型H1N1流感病毒2009大流行株感染野生小鼠（WT）、CRP基因敲除小鼠（CRP-KO）和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠(CRP-KI)體重和致死率變化;(B)H7N9禽流感病毒疫苗小鼠適應(yīng)株感染野生小鼠（WT）、CRP基因敲除小鼠（CRP-KO）和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠(CRP-KI)體重和致死率變化;（B）柯薩奇病毒B3感染野生小鼠（WT）、CRP基因敲除小鼠（CRP-KO）和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠(CRP-KI)體重變化。

1、CRP基因敲除小鼠構(gòu)建

利用CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因組工程技術(shù)建立CRP基因敲除小鼠（C57/6J），小鼠染色體庫：第37000000號小鼠染色體：第1號染色體，鑒定出兩個外顯子，ATG起始密碼子在外顯子1，TGA終止密碼子在外顯子2。外顯子1到外顯子2被選為靶位點(diǎn)，然后將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的Cas9 mRNA和gRNA注射到受精卵中進(jìn)行基因敲除小鼠生產(chǎn)。通過PCR和DNA測序分析進(jìn)行基因分型鑒定F0小鼠，并將其育成野生型小鼠，進(jìn)行種系傳代并鑒定，篩選F1代雜合子。F1代小鼠間進(jìn)行交配后產(chǎn)生F2代小鼠，對F2小鼠進(jìn)行PCR基因鑒定，篩選純合子小鼠。純合子小鼠間再進(jìn)行交配傳代并進(jìn)行鑒定，連續(xù)傳3代，并進(jìn)行鑒定，得到穩(wěn)定傳代系CRP基因敲除小鼠。 分別將流感病毒、柯薩奇病毒通過滴鼻和腹腔注射的方式感染小鼠，同時設(shè)定野生小鼠對照，定期采樣分析病毒對小鼠的感染性，同時評價病毒對小鼠的致病性，分析CRP基因敲除對病毒致病性的影響。

2、人CRP基因轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

利用CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因組工程技術(shù)建立人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠（C57/6J），將含有人CRP cDNA的供體載體ROSA26的gRNA與cas9mRNA共同注射進(jìn)入受精的老鼠卵中，產(chǎn)生靶向敲入的后代。F0建立動物經(jīng)PCR鑒定然后進(jìn)行序列分析，對野生型小鼠進(jìn)行種系傳代和F1代檢測鑒定，篩選純合子小鼠。純合子小鼠間再進(jìn)行交配傳代并進(jìn)行鑒定，連續(xù)傳3代，并進(jìn)行鑒定，得到穩(wěn)定傳代系CRP基因敲除小鼠。 分別將流感病毒、柯薩奇病毒通過滴鼻和腹腔注射的方式感染小鼠，同時設(shè)定野生小鼠對照，定期采樣分析病毒對小鼠的感染性，同時評價病毒對小鼠的致病性，分析人CRP轉(zhuǎn)基因?qū)Σ《局虏⌒缘挠绊憽?/p>

一、疾病概述

多種急性病毒性傳染病會出現(xiàn)明顯的免疫病理性損傷表現(xiàn)，從而出快速進(jìn)展性重癥感染、多組織損傷等病癥，如禽流感病毒（H5N1、H5N6、H7N9）重癥感染、SARS、重癥手足口病等。其共同的表現(xiàn)是引起細(xì)胞因子風(fēng)暴或者高炎癥因子反應(yīng)，并多伴有多器官損傷的表現(xiàn)。已有的證據(jù)已經(jīng)顯示，免疫損傷在這些病毒感染的致病機(jī)制中起重要作用，有研究提示對禽流感、SARS等病毒感染進(jìn)行炎癥因子的控制有助于病例的恢復(fù)。因此，免疫損傷應(yīng)是防控中不可或缺的一部分，構(gòu)建免疫損傷相關(guān)動物感染模型，對于相關(guān)傳染病的病理評估及相關(guān)控制策略的制定有著重要的意義。

二、模型背景

1、C-反應(yīng)蛋白（細(xì)胞/基因/病原/其他造模因素）信息

C-反應(yīng)蛋白(CRP)是穿透素家族成員之一，是宿主經(jīng)典急性期反應(yīng)蛋白，其通過細(xì)胞因子被激活，進(jìn)而啟動補(bǔ)體反應(yīng)系統(tǒng)、招募免疫細(xì)胞在組織中積聚促進(jìn)炎性反應(yīng)、促進(jìn)組織細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效用。CRP 是一個磁盤樣五聚體分子，由五個相同的含有206 個氨基酸的單體組成，其是一個鈣離子依賴性的免疫調(diào)節(jié)蛋白，每個CRP 單體上有兩個Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)。盡管CRP 的生物功能仍然存在爭議和很多不明確的地方，但是它作為先天性免疫反應(yīng)擔(dān)任重要角色是確定的。五聚體 CRP（pCRP)主要存在于體液循環(huán)中，在一定的條件下可被分解為CRP 單體（mCRP)，而mCRP 被認(rèn)為是組織細(xì)胞結(jié)合特性的效應(yīng)分子，通過膜融合、吞噬或者與配體結(jié)合在細(xì)胞表面形成微顆粒傳遞炎癥刺激信號，從而在炎癥擴(kuò)散和積聚中發(fā)揮作用。

2、實(shí)驗(yàn)動物背景信息

本研究采用C57BL/6J小鼠作為CRP基因敲除鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠的的構(gòu)建，C57BL/6J是第一個被全基因組測序的小鼠品系，被廣泛用于科研和藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域，C57BL/6J也被廣泛用作基因工程小鼠的背景品系。此外C57BL/6J對多種病毒敏感，可作為流感病毒、柯薩奇病毒等感染模型使用。

3、研究背景

C反應(yīng)蛋白（C reaction protein, CRP）是一種重要的炎癥反應(yīng)先天免疫調(diào)節(jié)因子，目前的研究顯示，CRP 具有激活補(bǔ)體系統(tǒng)、招募免疫細(xì)胞在組織中積聚促進(jìn)炎性反應(yīng)、促進(jìn)組織細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效用。在禽流感病毒（H5N1、H5N6、H7N9）重癥感染、重癥手足口病等急性傳染病病例中，CRP均顯示明顯提高，且與疾病的轉(zhuǎn)歸存在潛在關(guān)系。因此，針對CRP在急性傳染病免疫損傷中的作用研究有著重要的意義。而CRP是一個具有高度保守性的急性期反應(yīng)蛋白，小鼠的CRP和人CRP具有高度相似性，人CRP的能夠結(jié)合小鼠的Fc?R激活補(bǔ)體反應(yīng)。本研究擬構(gòu)建人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠和CRP基因敲除小鼠，建立流感病毒、柯薩奇病毒等感染免疫損傷相關(guān)小鼠模型，形成感染免疫損傷評價體系，為急性傳染病的防控策略的建立提高依據(jù)。

近年來的研究顯示，CRP基因敲除小鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)在心肌梗死、急性肝損傷、急性腎損傷等多種疾病研究得到應(yīng)用 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 1-4。研究結(jié)果顯示， CRP在自身免疫性損傷相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用，并可能作為靶向治療的一個潛在分子。