本課題組采用7日齡ICR乳鼠、經(jīng)腹腔注射CA10病毒的感染途徑，成功獲得CA10病毒感染小鼠模型。模型建立過程中采用臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)感染后動(dòng)物的臨床癥狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，并記錄死亡率和體重情況；同時(shí)采用熒光定量PCR-標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)感染后動(dòng)物血液和組織中的病毒載量進(jìn)行測(cè)定，以確定病毒的復(fù)制情況。

本CA10病毒感染小鼠模型與文獻(xiàn)報(bào)道的泰山醫(yī)學(xué)院的史衛(wèi)峰教授課題組的ICR乳鼠感染模型，都采用國際通用的封閉群ICR小鼠的乳鼠作為感染對(duì)象，都得到了具有典型神經(jīng)系統(tǒng)病癥的小鼠感染重癥模型。在感染4天后動(dòng)物出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，包括駝背或炸毛，后肢無力，單后肢癱瘓，雙后肢癱瘓，嚴(yán)重的直至死亡；之后幾日臨床評(píng)分不斷升高，最終感染小鼠全部死亡。采集感染小鼠的血液和后肢肌肉組織樣本，檢測(cè)到病毒載量從第1天的低于檢測(cè)水平（<200 copies/ul）上升到第3天的高水平（>106 copies/μl），說明病毒在機(jī)體內(nèi)的大量復(fù)制擴(kuò)增；尤其是在肌肉組織中病毒載量的結(jié)果與臨床癥狀相吻合。兩者的不同之處在于：使用的病毒株不同，來自于不同病人的臨床分離株；小鼠的日齡不同，我們使用7日齡的ICR乳鼠，相對(duì)于5日齡小鼠更易于操作；感染途徑不同，我們采用腹腔注射感染的方式，而非采用肌肉注射感染方式，更有利于觀察和研究CA10病毒的嗜肌性。

CA10病毒感染模型的建立需要確定乳鼠的日齡和感染的劑量。由于CA10病毒對(duì)5歲以下兒童易感，相應(yīng)的CA10病毒也只能使乳鼠在感染后表現(xiàn)出癥狀。我們?cè)囼?yàn)了7日齡和10日齡的乳鼠，發(fā)現(xiàn)10日齡乳鼠感染后癥狀表現(xiàn)不穩(wěn)定，因此選取了7日齡乳鼠作為感染動(dòng)物。對(duì)于病毒感染劑量，我們也嘗試了103、104、105 TCID50，選擇了癥狀更為合適和穩(wěn)定的104 TCID50。由于近幾年CA10病毒成為我國手足口病的主要病原之一，引起廣泛關(guān)注；而CA10病毒感染小鼠模型不僅可用于研究病毒的感染機(jī)制和機(jī)體的免疫反應(yīng)，更是開發(fā)相應(yīng)的特異性藥物和疫苗的重要基礎(chǔ)。

CA10病毒在人間傳染病名錄中屬于第三類，涉及的實(shí)驗(yàn)需在BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室開展。CA10病毒已經(jīng)過風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，具有相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

CA10病毒對(duì)5歲以下兒童易感，主要通過糞口傳播，對(duì)于具有BSL-2防護(hù)裝備的實(shí)驗(yàn)人員危害較小；實(shí)驗(yàn)人員均經(jīng)過生物安全培訓(xùn)獲得證書；進(jìn)入動(dòng)物房之前，穿戴防護(hù)服、口罩、帽子、鞋套，防護(hù)眼鏡等進(jìn)行防護(hù)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按要求去除防護(hù)設(shè)備集中處理。

成年ICR小鼠對(duì)CA10病毒不敏感，21日齡ICR小鼠在感染大劑量病毒后仍能自愈。對(duì)于感染動(dòng)物的排泄物進(jìn)行檢測(cè)，在少數(shù)糞便樣本中檢測(cè)到少量病毒，載量約為2X102-103copies/mg；因此需對(duì)墊料等接觸動(dòng)物糞便的物品按要求進(jìn)行高壓滅菌處理。

動(dòng)物感染病毒后取得的血液和組織直接放入核酸裂解液或組織固定液，滅活病毒。所有涉及到的相關(guān)污染物如離心管、注射器、手術(shù)剪、手術(shù)鑷和毒株等將統(tǒng)一高溫高壓消毒后集中處理。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在ABSL-2動(dòng)物房的生物安全柜中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)后將病毒毒株、動(dòng)物尸體、尿墊等包裝好進(jìn)行高壓滅菌處理，注射器放入利器桶處理。

1. 動(dòng)物癥狀觀察：

7日齡ICR小鼠感染CA10病毒4天后，出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，癥狀由輕到重包括：駝背或炸毛，后肢無力，單后肢癱瘓，雙后肢癱瘓，嚴(yán)重的直至死亡。感染后第5天，感染小鼠臨床癥狀評(píng)分超過4分（圖1A）；感染后第7天，感染小鼠全部死亡（圖1B）。相對(duì)于正常組小鼠，感染小鼠體重增加減緩，從感染第1天的5.57g增加到第6天的7.33g，而正常小鼠從5.64g增加到8.03g（圖1C）。

圖1. ICR7日齡乳鼠感染CA10病毒后癥狀觀察。A，感染后乳鼠的臨床癥狀評(píng)分時(shí)間變化曲線；B，感染后乳鼠的存活率時(shí)間變化曲線；C，感染后乳鼠體重隨時(shí)間變化曲線。

2. 血液和組織中病毒復(fù)制情況：

感染后第1天血液和肌肉組織中病毒載量都低于檢測(cè)閾值。到第3天血液中病毒載量到達(dá)高水平1.7X107 copies/μl，隨后血液中病毒載量下降至1.1X105copies/μl。后肢肌肉的病毒載量在感染后第3天和第5天都維持很高的水平，分別為2.9X107 copies/mg和6.1X107 copies/mg。

圖2. ICR7日齡乳鼠感染CA10病毒后血液和組織中病毒載量情況。A，感染后第3天和第5天血液中病毒載量情況； B，感染后第3天和第5天后肢肌肉組織中病毒載量情況。

動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法

1. 臨床癥狀觀察：

動(dòng)物感染CA10病毒后觀察10天，每天記錄體重變化、癥狀和死亡率。根據(jù)癥狀嚴(yán)重程度，參照以下標(biāo)準(zhǔn)低動(dòng)物進(jìn)行臨床評(píng)分打分：

0：未見異常；

1：駝背或炸毛；

2：后肢遲緩無力；

3：單后肢癱瘓；

4：雙后肢癱瘓；

5：死亡。

2. CA10病毒載量測(cè)定方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

2.1取樣：分別在感染后第1天、第3天、第5天處死動(dòng)物，采集血液100ul和后肢肌肉組織樣本50mg，放入Trizol中；

2.2 RNA提?。翰捎肨rizol法提取血液和肌肉組織中的RNA；

2.3 一步法熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸濃度：

（1）特異性引物和Taqman探針：

Forwardprimer：GAAATGGRGTGTTGGAAACCA，

Reverseprimer：TTTCTGCGRAGTTGGACAAAG，

Probe:FAM-ATCAACCAYTTCTTCTCYCGCTCTGG-TAM；

（2）標(biāo)準(zhǔn)品：合成的CA10病毒核酸片段，濃度梯度為：2X109copies/μl、2X108copies/μl、2X107copies/μl、2X106copies/μl、2X105copies/μl、2X104copies/μl、2X103copies/μl、2X102copies/μl。共8個(gè)稀釋梯度，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。

（3）陰性對(duì)照和陽性對(duì)照：陰性對(duì)照用水代替核酸樣本；陽性對(duì)照采用CA10病毒儲(chǔ)液提取得到的核酸；

（4）熒光定量PCR試劑盒：Qiagen RNeasy Mini Kit（貨號(hào):74106），根據(jù)試劑盒要求準(zhǔn)備反應(yīng)體系；

（5）反應(yīng)條件：①反轉(zhuǎn)過程：50℃ 30min；②PCR過程：95℃ 15min；94℃ 15s，60℃ 60s，該步驟循環(huán)數(shù)為40；

（6）實(shí)驗(yàn)儀器：ABI Q3熒光定量PCR儀

（7）結(jié)果分析：

① 反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下條件，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。陰性對(duì)照：無擴(kuò)增，為陰性。

② 標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2大于0.95可用，若低于0.95數(shù)據(jù)不可用，則需重新測(cè)定；

③ 結(jié)果判斷：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出CA10病毒的載量。病毒載量的檢測(cè)閾值為2X10^{2 copies/μl，低于該數(shù)值的結(jié)果不可信。}

評(píng)價(jià)指標(biāo)體系：

1. 臨床癥狀評(píng)價(jià)：CA10病毒感染成功模型應(yīng)具有典型的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，即可觀察到動(dòng)物的重癥肌無力表型，包括單后肢或雙后肢癱瘓，根據(jù)臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)感染CA10病毒5天后臨床癥狀可達(dá)到4-5分，死亡率在感染7天后可達(dá)到80%以上。

2. 血液和組織中病毒復(fù)制情況評(píng)價(jià)體系：動(dòng)物在感染CA10病毒后第1天、第3天、第5天采集血液和后肢肌肉組織樣本，測(cè)定其中的病毒載量。經(jīng)腹腔注射感染后，第1天病毒載量都低于檢測(cè)閾值。CA10病毒首先在血液中復(fù)制達(dá)到較高水平，第3天的檢測(cè)值在106 copies/μl以上，而到第5天血液中病毒載量出現(xiàn)下降，檢測(cè)值在104 copies/μl-105 copies/μl；而在后肢肌肉組織中，CA10病毒載量由第3天的2.9X107 copies/mg上升到6.1X107 copies/mg，說明病毒在肌肉中發(fā)生了大量擴(kuò)增，具有典型的嗜肌性，與臨床癥狀表現(xiàn)相吻合。

1. 病毒準(zhǔn)備：CA10病毒(GenBank: MF688814.1)，由醫(yī)院咽拭子分離得到，在人橫紋肌瘤細(xì)胞（RD）中培養(yǎng)、擴(kuò)增，并采用反復(fù)凍融法釋放病毒，離心富集病毒。具體操作如下：

RD細(xì)胞經(jīng)常規(guī)傳代培養(yǎng)接種到T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，感染前棄去原培養(yǎng)基，細(xì)胞用含2%雙抗的PBS 洗2遍，吸出PBS后加入無血清DMEM培養(yǎng)基。接種適量的CA10病毒后，置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育1-2h；加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。接種病毒后2-3d病變CPE達(dá)到+++～++++，將T75細(xì)胞瓶置封口袋中，-80℃超低溫冰箱凍化3次。然后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，4℃，2000rpm離心20min，沉淀細(xì)胞碎片。吸取病毒上清，分裝后凍存，并測(cè)定病毒滴度TICD50。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：采用SPF級(jí)7日齡ICR小鼠乳鼠，母鼠自然哺乳，在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立飼養(yǎng)。CA10動(dòng)物模型建立實(shí)驗(yàn)通過IACUC審核，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求。

3. 病毒感染：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的感染劑量，即104TCID50CA10病毒，將病毒經(jīng)腹腔注射感染小鼠，注射劑量為100μl。對(duì)照組注射同等量的RD細(xì)胞上清。

一、疾病概述

手足口病是由腸道病毒引起的傳染病，多發(fā)生于5歲以下兒童，表現(xiàn)口痛、厭食、低熱、手、足、口腔等部位出現(xiàn)小皰疹或小潰瘍，多數(shù)患兒一周左右自愈，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。個(gè)別重癥患兒病情發(fā)展快，導(dǎo)致死亡。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種（型），自2008年在新加坡的暴發(fā)流行，柯薩奇病毒A10型（CoxsackievirusA10，CA10）成為手足口病主要致病血清型之一，由其感染引起的手足口病爆發(fā)事件在法國、芬蘭、印度等國家和地區(qū)不斷被報(bào)道。2013年以前，中國多地區(qū)暴發(fā)流行的手足口病病原以EV71和CA16為主，CA6和CA10次之。2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐漸上升，成為國內(nèi)手足口病感染的優(yōu)勢(shì)病原體之一。CA10共分為A～G的7個(gè)基因型。目前國內(nèi)外大多通過與周邊地區(qū)或其他國家的流行株進(jìn)行核苷酸和氨基酸的同源性對(duì)比，來分析CA10的流行情況。在我國，CA10近年來在多地區(qū)流行的病毒株保持著較高的同源性，與其他國家的分離株之間的同源性距離較遠(yuǎn)，具有地域分布特點(diǎn)以及一定的時(shí)間分布特點(diǎn)。CA10傳染性強(qiáng)、隱性感染比例大、傳播途徑復(fù)雜、傳播速度快，在短時(shí)間內(nèi)可造成較大范圍的流行，疫情控制難度大。

CA10病毒主要通過糞口途徑傳播，主要經(jīng)胃腸道進(jìn)入機(jī)體內(nèi)。病毒在入侵的局部上皮細(xì)胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴組織中繼續(xù)增殖并釋放入血導(dǎo)致第一次病毒血癥。病毒隨血液傳播接觸到正常靶細(xì)胞。病毒表面的VP1蛋白與靶細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，完成吸附過程，其基因組RNA進(jìn)入胞質(zhì)。之后，病毒以其正鏈RNA作為模板，合成互補(bǔ)的負(fù)鏈RNA，又以負(fù)鏈RNA為模板合成病毒正鏈RNA，從而得到大量病毒RNA，進(jìn)入子代病毒顆粒組裝階段。通過轉(zhuǎn)錄、翻譯，復(fù)制出二代病毒，再次釋放入血形成第二次病毒血癥并引起臨床癥狀。目前有大量研究表明，手足口病患兒的細(xì)胞免疫出現(xiàn)紊亂，并且這種免疫紊亂在重癥與死亡病例中表現(xiàn)得更加嚴(yán)重。肺水腫被認(rèn)為是感染的患兒中是最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，腦干的損傷則被認(rèn)為是導(dǎo)致肺水腫的重要因素。很多研究表明參與細(xì)胞免疫的諸多炎性因子，例如IL-1、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α的增加、T細(xì)胞亞群CD3+CD4+，以及自然殺傷細(xì)胞（NK）等，與肺水腫的發(fā)生具有相關(guān)性。

CA10易感染5歲以下年齡的幼兒，潛伏期多為2-10天。CA10感染兒童多引起輕型手足口病，患兒往往無明顯的早期癥狀，大多數(shù)病人預(yù)后良好。臨床上，往往表現(xiàn)為多發(fā)的斑丘疹和（或）皰疹，最多見于手足口、臂及膝關(guān)節(jié)。典型皰疹通常突出皮膚表面，呈現(xiàn)黃豆粒大小，圓形或橢圓形，其內(nèi)液體混濁，常無疼痛和瘙癢感，約1周時(shí)間皰疹可自行消退，通常不留疤痕。病人或伴有發(fā)熱、流涕、咳嗽、食欲不振、惡心、嘔吐或腹瀉等癥狀，一般能自愈，無后遺癥。但少數(shù)兒童感染CA10后出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹和神經(jīng)呼吸綜合征等。隨著CA10流行程度的增加、重癥病例的出現(xiàn)，開發(fā)針對(duì)性的抗病毒藥物和疫苗成為當(dāng)務(wù)之急，而建立穩(wěn)定的CA10感染動(dòng)物模型不僅是開發(fā)藥物和疫苗的關(guān)鍵點(diǎn)之一，也為研究病毒的感染機(jī)制和機(jī)體免疫反應(yīng)提供研究基礎(chǔ)。

二、模型背景

1、CA10病毒信息

CA10屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬；病毒顆粒呈20面體立體對(duì)稱球形，直徑為23-30μm，無包膜和突起，裸露的核衣殼由核酸和蛋白質(zhì)組成。CA10基因組為單股正鏈RNA，全長約7.4 kb。CA10基因組兩端為保守的非編碼區(qū)，中間為一個(gè)獨(dú)立的連續(xù)的開放閱讀框架（ORF）?；蚪M的順序依次為5'端非編碼區(qū)，P1區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)和一段3'端非編碼區(qū)。CA10病毒可用RD細(xì)胞培養(yǎng)，在37℃培養(yǎng)，48-96h達(dá)到高峰，在宿主細(xì)胞漿內(nèi)增殖，迅速引起細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓脫落，病毒顆粒破膜釋放。CA10的感染可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高低度的抗體，具有中和作用，能夠抵抗再次的感染。同時(shí)血清中的抗體與其他腸道病毒間存在嚴(yán)重的交叉免疫反應(yīng)。2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐漸上升，成為國內(nèi)手足口病感染的優(yōu)勢(shì)病原體之一。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

ICR小鼠毛色白化。適應(yīng)性強(qiáng)，體格健壯，繁殖力強(qiáng)，生長速度快，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好，雌鼠自發(fā)性畸胎瘤和管狀腺瘤發(fā)病率為0%-1%，用氨基甲酸乙酯誘發(fā)時(shí)，11-16天胚胎期畸胎瘤和管狀腺瘤發(fā)病率為5.9%，離乳個(gè)體管狀腺瘤和囊瘤發(fā)生率為30%,孕鼠為3%。是國際通用的封閉群小鼠。外周血項(xiàng)和骨髓細(xì)胞，具有較好的穩(wěn)定性，是良好的血液學(xué)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物。是進(jìn)行手足口病原研究的理想動(dòng)物。

3、研究背景

隨著CA10流行程度的增加、重癥病例的出現(xiàn)，開發(fā)針對(duì)性的抗病毒藥物和疫苗成為當(dāng)務(wù)之急，而建立穩(wěn)定的CA10感染動(dòng)物模型不僅是開發(fā)藥物和疫苗的關(guān)鍵點(diǎn)之一，也為研究病毒的感染機(jī)制和機(jī)體免疫反應(yīng)提供基礎(chǔ)。

目前國內(nèi)的CA10病毒動(dòng)物感染模型有泰山醫(yī)學(xué)院的史衛(wèi)峰教授課題組的ICR乳鼠感染模型，采用5日齡ICR乳鼠感染CA10細(xì)胞適應(yīng)株TA151R，感染劑量為1.5X103TCID50，感染途徑為肌肉注射（Protective Efficacies ofFormaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine and Antivirals in a Murine Modelof Coxsackievirus A10 Infection. Journal of Viology, 2017, Volume 91, Issue 13:e00333-17.）。