1. 動(dòng)物癥狀觀察與野生型斑馬魚相比，斑馬魚幼體暴露于 MPTP 后，出現(xiàn)類似人類 PD 患者的行走不穩(wěn)、反應(yīng)遲緩、靜止性震顫。PD 模型斑馬魚的游泳速度明顯變緩，泳速和游泳持續(xù)時(shí)間明顯減低，甚至靜止時(shí)伴有身體抖動(dòng)，對(duì)觸及刺激反應(yīng)遲緩且反應(yīng)強(qiáng)度減低（圖 1）。與臨床癥狀相符。

2. 生物標(biāo)志物方面：PD 的蛋白標(biāo)志物 β-SYNUCLIN、PARKIN、PINK1 明4顯高于正常對(duì)照斑馬魚；神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物酪氨酸羥化酶蛋白(TH)明顯減少，提示多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡數(shù)增多（圖 1）。

3. 多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少。但，神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi) th 基因表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，類似于人 PD 早期腦多巴胺神經(jīng)元死亡后存活神經(jīng)元的代償性 TH 高表達(dá)。（圖 2）

圖1. MPTP造成斑馬魚幼體運(yùn)動(dòng)減少，PD標(biāo)志基因/蛋白水平升高斑馬魚幼體(5 dpf)暴露于50 μM的MPTP中24小時(shí)，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)活性（運(yùn)動(dòng)距離、持續(xù)時(shí)間和速度）檢測20分鐘。A．散點(diǎn)圖顯示幼體運(yùn)動(dòng)行為的統(tǒng)計(jì)學(xué)變化；右側(cè)顯示一組代表性運(yùn)動(dòng)軌跡圖(5分鐘軌跡)。B–E, 斑馬魚暴露于100和200 μMMPTP 24小時(shí)后，檢測PD相關(guān)的標(biāo)志基因和蛋白: TH (B)、β-syn (C)、Parkin (D)和PINK1 (E)。*, p values_0.05; **, p values_0.01; ***, p values_0.001。(one-wayANOVA)。

圖 2. MPTP 導(dǎo)致斑馬魚幼體中腦多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少A. 以酪氨酸羥化酶基因(th)反義 RNA 為探針，采用原位雜交方法檢測斑馬魚幼體中腦多巴胺神經(jīng)元數(shù)量和 th 基因表達(dá)強(qiáng)度。B. 原位熒光免疫實(shí)驗(yàn)檢測酪氨酸羥化酶，綠色熒光斑點(diǎn)顯示斑馬魚幼體中腦多巴胺神經(jīng)元數(shù)量和分布。一抗抗體為酪氨酸羥化酶抗體。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級(jí)老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物用水均經(jīng)過除菌處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

（1） 癥狀觀察斑馬魚幼體（6 dpf）行為: 考察、記錄其游泳速度和姿態(tài)、持續(xù)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離；靜止時(shí)身體平衡情況、有無顫抖等。

（2） 生物標(biāo)志物檢測斑馬魚暴露于 MPTP 中持續(xù) 24 小時(shí)，收集幼體，提取總 RNA 和蛋白，進(jìn)行 RT-PCR 和 Western blotting 檢測 PD 相關(guān)的基因和蛋白：TH、β-SYNUCLIN、PARKIN、PINK1。

（3） 病理診斷采取原位雜交和原位免疫熒光方法，檢測斑馬魚中腦/間腦多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量和分布變化。

1. 造模化合物1-甲基－4－苯基－1,2,3,6－四氫吡啶（MPTP）是一種神經(jīng)毒素，常用于制作帕金森病動(dòng)物模型。2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型斑馬魚 AB 或 TU 品系。斑馬魚飼養(yǎng)和管理均按照常規(guī)方法。飼養(yǎng)空間溫度 28-30°C。3. 造模化合物處理MPTP 為 Sigma (M0896) 產(chǎn)品，MPTP 母液用純水制備，濃度為100 μM，儲(chǔ)存于－20 °C. MPTP工作液用飼養(yǎng)液稀釋至50、100、200、500 μM。將斑馬魚2幼體暴露于MPTP 工作液24小時(shí)，收集幼體，進(jìn)行下一步處理。4. RT-PCR檢測PD相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

收集斑馬魚于 TRIzol reagent (Sigma).提取總 RNA，進(jìn)行 RT-PCR 檢測 PD相關(guān)的基因表達(dá)水平。PCR 引物見表 1。

5. 原位RNA雜交收集斑馬魚于4% paraformaldehyde固定。Th基因探針片段為PCR產(chǎn)物（表1），并被克隆到載體pGEM-T質(zhì)粒上。探針的合成按照試劑盒(DIG RNA labeling kit(Roche Applied Science, 1175041)）說明制備th基因RNA雜交探針。按照操作程序?qū)唏R魚樣本與探針溫育、檢測、拍照。

6. 原位免疫熒光檢測按照常規(guī)程序，將斑馬魚幼體與TH蛋白單克隆抗體(Minipore, MAB318)溫育，然后用FITC-標(biāo)記的二抗溫育、洗滌，顯微鏡下檢測、拍照。

7. Western blotting用RIPA lysis kit (Applygen Technologies Inc., C1053)提取斑馬魚總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，用PD相應(yīng)蛋白的抗體和二抗進(jìn)行檢測。β-ACTIN抗體，3mouse anti-human ACTB antibody (Zhongshan Goldbridge, TA09); 小鼠anti-GAPDH mAb (Zhongshan Goldbridge, TA08); 兔anti-mouse TH monoclonalantibody (Minipore, MAB318); PINK1 (D8G3) 兔mAb antibody (CST, catalog no.6946); Parkin mAb antibody (CST, catalog no. 4211); β-syn (Syn205) 小鼠mAbantibody (CST, catalog no. 2644)。

8. 斑馬魚行為學(xué)實(shí)驗(yàn)幼體行為記錄采用ZebraLab (法國Viewpoint, ZebraLab 3.3)儀器，幼體逐個(gè)放入96-孔板，(1 fish/well). 記錄運(yùn)動(dòng)距離、游泳持續(xù)時(shí)間、速度和游泳軌跡。每5分鐘記錄一次數(shù)據(jù)。

一、疾病名稱 帕金森疾病 (Parkinson’s disease, PD)二、臨床發(fā)病機(jī)制及癥狀 帕金森疾病是中老年人的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，發(fā)病年齡在 40－70 歲之間。PD 發(fā)病與以下因素相關(guān)：1.腦老化，隨人的增齡，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元不斷死亡，當(dāng) 80％的神經(jīng)元死亡時(shí)可出現(xiàn) PD 癥狀。2. 具有遺傳性，a-突觸核蛋白及 Parkin 等基因突變與少數(shù)家族性 PD 相關(guān)。3.環(huán)境因素，一些外源性或內(nèi)源性毒素可引起黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元死亡，如海洛因吸食者出現(xiàn) PD 樣癥狀，后者被證實(shí)含有神經(jīng)毒素 MPTP。4. 其它疾病和外傷導(dǎo)致的腦神經(jīng)損傷，如腦梗等腦血管病變和創(chuàng)傷導(dǎo)致的腦神經(jīng)元死亡。臨床 PD 主要有 4 大癥狀：靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)緩慢或少動(dòng)、肌強(qiáng)直及姿態(tài)平衡障礙。