給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實(shí)驗(yàn)還對CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會導(dǎo)致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點(diǎn)，以避免動物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預(yù)測應(yīng)激模型，通過水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評價。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物用水均經(jīng)過除菌處理。實(shí)驗(yàn)動物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1. 物體認(rèn)知檢測結(jié)果

OVX小鼠8W時在新物體識別實(shí)驗(yàn)中其相對辨別指數(shù)顯著降低，即8W的模型動物其對新舊物體的辨別能力降低。

圖2不同造模時長的卵巢摘除模型物體認(rèn)知（新物體）能力情況

2. 避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與假手術(shù)組（Sham組）相比，OVX小鼠4W時在避暗實(shí)驗(yàn)中其入暗潛伏期顯著降低，錯誤次數(shù)、暗室時間和明室近口區(qū)時間顯著增加。

圖3不同造模時長的卵巢摘除模型在避暗實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)-暗室時間

圖4不同造模時長的卵巢摘除模型在避暗實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)-錯誤次數(shù)

3. 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

OVX小鼠8W時在水迷宮中工作記憶實(shí)驗(yàn)的潛伏期顯著增加，8W時模型動物的空間工作記憶能力出現(xiàn)損傷。

圖5不同造模時長的卵巢摘除模型在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)-工作記憶潛伏期

雌性ICR小鼠或者C57Bl/6雌鼠，8-12周齡，造成參考記憶障礙造模時長需4周以上。常規(guī)飼養(yǎng)。

1. 卵巢摘除術(shù)

結(jié)合Merle E及常艷報道的小鼠卵巢摘除術(shù)的方法，操作步驟如下：小鼠稱重，4%水合氯醛溶液(400mg/kg bw)腹腔注射麻醉；將小鼠呈俯臥式固定于手術(shù)板上，以其兩側(cè)后肢大腿根部上緣連線與背部正中線交點(diǎn)以上0.5cm左右為中心，沿背部后中線作一長約0.5-1cm的皮膚切口；沿皮下組織向左側(cè)游離大約0.5cm，可見菲薄的肌層下方發(fā)亮的脂肪組織；用鑷子提起脂肪團(tuán)表面肌層，縱行剪開肌層，在脂肪組織中找到左側(cè)卵巢；結(jié)扎子宮角末端，摘除左側(cè)卵巢、輸卵管和一小部分子宮角，縫合剪開的肌層；同法向右游離切除右側(cè)卵巢；最后縫合背部皮膚；假手術(shù)組除不摘除卵巢外其余操作和模型組相同；術(shù)后24h以后對小鼠行至少連續(xù)5天的陰道涂片檢查，判斷卵巢摘除是否完全。

圖1卵巢摘除過程

2. 陰道涂片檢查

為評價卵巢摘除是否徹底，術(shù)后連續(xù)5天每天固定時間行陰道涂片檢查，方法如下：用小鼠灌胃針吸取大約兩滴生理鹽水，在小鼠陰道內(nèi)吸打3-4次；吸出適量陰道液置于96孔板中，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察；陰道細(xì)胞檢查結(jié)果角化細(xì)胞均不超過50%判定為卵巢摘除徹底。

3. 模型分析指標(biāo)

（1）物體認(rèn)知-新物體識別 實(shí)驗(yàn)過程分為3個階段：適應(yīng)期、熟悉期、測試期。適應(yīng)期為3天，每天將動物背對箱體依次放入實(shí)驗(yàn)箱中部位置后開始使之適應(yīng)實(shí)驗(yàn)箱環(huán)境10 min。適應(yīng)期結(jié)束后，次日進(jìn)行熟悉期和測試期。熟悉期，將兩個完全相同的物體放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)相鄰的磁鐵處固定，記錄小鼠5 min內(nèi)對兩物體的探索行為，比較動物對熟悉物體A1和熟悉物體A2的探索時間來評價動物對物體所在位置是否存在偏愛性，用動物對物體對的總探索時間來評價動物對物體的探索能力是否存在偏差。間隔30 min后開始測試期，將其中一個熟悉物體變換為新物體，另一熟悉物體保持不變。記錄小鼠在測試期內(nèi)對新穎物體和原熟悉物體的探索時間，用相對辨別指數(shù)來評價動物的學(xué)習(xí)記憶能力。相對辨別指數(shù)計算公式為DI = (N-F) /(N+F) ×100%，其中N（new）為動物對新穎物體的探索時間，F(xiàn)（familiar）為動物對原熟悉物體的探索時間。

在實(shí)驗(yàn)過程中，為避免動物對某一位置產(chǎn)生偏愛，物體的位置要相互平衡，以便減少實(shí)驗(yàn)誤差。新物體識別實(shí)驗(yàn)反映的是動物對物體辨別的短時、非空間記憶能力。

（2）避暗實(shí)驗(yàn) 避暗實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒類動物趨暗避明的習(xí)性設(shè)計，當(dāng)動物進(jìn)入暗室即遭足底電擊，反復(fù)數(shù)次后形成條件反射。該實(shí)驗(yàn)用于檢測嚙齒類動物的短時學(xué)習(xí)記憶和再現(xiàn)能力。實(shí)驗(yàn)分為避暗學(xué)習(xí)Day1和避暗鞏固Day2兩個階段，歷時2d。

避暗學(xué)習(xí)階段Day1：首先將避暗實(shí)時在線軟件系統(tǒng)設(shè)置為：刺激電流1.5mA，刺激電壓30V，實(shí)驗(yàn)時間5min。接著在開始實(shí)驗(yàn)前將動物背朝通道小門放入明室自由活動5min適應(yīng)測試箱體環(huán)境后取出。隨后開始避暗學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)，在攝像頭識別到動物第一次進(jìn)入暗室后，暗室柵欄開始通電，動物遭受電擊會逃到明室，持續(xù)5分鐘，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。避暗學(xué)習(xí)結(jié)束后立即將動物放回睡眠干擾儀內(nèi)繼續(xù)睡眠干擾。

避暗鞏固階段Day2：避暗學(xué)習(xí)后24h進(jìn)行。參數(shù)設(shè)置同前。將動物背朝通道小門放入明室立即開始實(shí)驗(yàn)，暗室即可通電，記錄5min內(nèi)錯誤次數(shù)(進(jìn)入暗室的次數(shù))，潛伏期(第一次從明室到暗室的時間)、暗室時間、明室時間、暗室路程等指標(biāo)評價動物的避暗記憶再現(xiàn)能力。

（3）水迷宮實(shí)驗(yàn)

3.1 水迷宮空間記憶

迷宮分為 4 個象限，將平臺置于其中一個象限中央，作為實(shí)驗(yàn)中動物逃離水環(huán)境的唯一途徑， 空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余 3 個象限作為動物的入水點(diǎn)將動物面向池壁放入水中，每天訓(xùn)練 3 次，每次變換入水點(diǎn)位置( 使動物可分別從 3 個象限入水)，且每天所有動物入水點(diǎn)的順序保持一致。每次訓(xùn)練前適應(yīng) 10 s，使動物獲取并學(xué)習(xí)空間環(huán)境信息。設(shè)置檢測時間為 60s 后，將動物放入水中，若動物在 60 s 內(nèi)找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息 10 s。若動物在 60 s內(nèi)未找到平臺，結(jié)束此次訓(xùn)練并記錄潛伏期為 60 s，并引導(dǎo)動物靠近平臺使其在平臺上停留 10 s。每只動物訓(xùn)練的時間間隔為 40 min。每天每只動物 3 次訓(xùn)練學(xué)習(xí)的潛伏期平均值，作為評價動物這一天學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。經(jīng)過 5d 的訓(xùn)練學(xué)習(xí)后，第 6 天撤去平臺， 進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，檢測其在 60s 內(nèi)在原平臺象限的游程比、時間比，以及穿過原平臺所在位置的次數(shù)，作為評價空間記憶能力的指標(biāo)。

3.2 水迷宮工作記憶

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日， 開始工作記憶實(shí)驗(yàn)。工作記憶歷時 3d，分別將平臺置于其余 3 個不同象限中，每天變換平臺位置，同一天內(nèi)平臺位置保持不變。每天訓(xùn)練 3 次，依次從其余 3 個非平臺象限將動物面朝池壁放入水中。訓(xùn)練前不予適應(yīng)， 其余同空間訓(xùn)練階段一致。計算 3 天中， 第 2 次訓(xùn)練潛伏期的平均值，作為評價動物學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

當(dāng)婦女進(jìn)入更年期后，卵巢功能降低，雌激素水平下降，雌激素對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)保護(hù)作用減弱，老年性癡呆等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患病風(fēng)險增加。目前常用的模擬更年期婦女雌激素低下的動物模型是卵巢摘除模型（ovariectomy/oophorectomy，簡稱ovx），可以很好的模擬更年期婦女雌激素低下的生理及病理狀態(tài)。