為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細(xì)胞中的功能，我們運(yùn)用CRISPER/Cas9技術(shù)對(duì)斑馬魚npsn進(jìn)行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點(diǎn)獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點(diǎn)處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測(cè)它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)于野生型斑馬魚出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號(hào)幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育，我們通過斑馬魚中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對(duì)比，mpx+和lyz+信號(hào)點(diǎn)的數(shù)量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量也沒有差異。并且進(jìn)一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細(xì)胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因?yàn)镹psn只是斑馬魚中性粒細(xì)胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細(xì)胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細(xì)胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對(duì)斑馬魚中性粒細(xì)胞功能的影響，而中性粒細(xì)胞的主要功能是參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實(shí)驗(yàn)。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對(duì)于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達(dá)水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細(xì)胞在抵抗細(xì)菌感染中存在功能缺陷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Npsn在中性粒細(xì)胞抵抗感染中的作用，我們通過構(gòu)建斑馬魚Npsn過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時(shí)感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過表達(dá)后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細(xì)菌感染。

但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細(xì)胞抵抗感染的呢？先前有體外實(shí)驗(yàn)證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的遷移來影響對(duì)大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)，我們觀察了在感染后4小時(shí)時(shí)傷口處中性粒細(xì)胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細(xì)胞的完整性，進(jìn)而影響大腸桿菌在機(jī)體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗(yàn)證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時(shí)感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對(duì)革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細(xì)胞抵抗細(xì)菌感染的具體機(jī)制，還需要更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應(yīng)模型，對(duì)研究在感染過程中，中性粒細(xì)胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對(duì)研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。

動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開展。動(dòng)物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1.模型的皮膚特征

兔耳緣靜脈及皮內(nèi)注射卵白蛋白生理鹽水溶液后，皮膚注射部位均會(huì)出現(xiàn)直徑1 cm左右的皮丘，6 h后模型組兔的背部皮丘逐漸變大，且周圍水腫，皮內(nèi)血液滲出；至18h左右，呈現(xiàn)片狀紫斑，直徑2-10mm，形狀不規(guī)則，大小不等，還有一些斑點(diǎn)出現(xiàn)在耳朵和腿部（圖1）。在激發(fā)第8天左右，皮膚紫癜開始變小，滲出減少，20天左右，癥狀明顯改善。皮膚癥狀出現(xiàn)的比例約為85%。

注：a、對(duì)照組兔的背部皮膚b、模型組兔的背部皮膚

圖1 激發(fā)后兔的外部特征觀察

2.模型病理特征

（1）臟器組織形態(tài)學(xué)改變

模型動(dòng)物病理表現(xiàn)為皮下出血，真皮水腫，血管擴(kuò)張充血、出血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；腎小球囊腔蛋白滲出物，血管擴(kuò)張充血及局灶性慢性腎炎，腎小球系膜基質(zhì)增多，系膜增厚，紅細(xì)胞管型，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等；還可見到關(guān)節(jié)腔滑膜淤血，結(jié)締組織壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等；胃黏膜可見出血，壞死脫落；小腸絨毛血管擴(kuò)張充血，上皮細(xì)胞脫落；肺淤血，肥大細(xì)胞似有脫顆粒現(xiàn)象；肝灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)等等（圖2）。

注：a.真皮水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；b.真皮血管充血，出血；c.皮膚正常對(duì)照；d.腎小球囊腔蛋白滲出物，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；e.腎小球系膜增厚，血管擴(kuò)張；f.腎正常對(duì)照；g. 關(guān)節(jié)滑膜淤血，結(jié)締組織壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；h.胃黏膜水腫，上皮細(xì)胞脫落；i.肺淤血，伴肥大細(xì)胞脫顆粒。

圖2 過敏性紫癜兔模型的組織病理改變

（2）皮膚、腎臟免疫復(fù)合物沉積

免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IgA免疫復(fù)合物在模型組兔皮膚主要沉積在皮膚真皮層血管壁、腎小球系膜區(qū)，血管壁及腎小球入球小動(dòng)脈壁，常呈斑點(diǎn)狀、團(tuán)塊狀、分支狀或短線狀分布（圖3）。

注：a.模型組兔皮膚組織，b. 對(duì)照；e.模型組兔腎臟組織，f 對(duì)照。

圖3 皮膚和腎臟的免疫熒光檢測(cè)

（3）腎小球纖維增生性改變

腎臟Masson染色結(jié)果顯示模型組動(dòng)物（a）腎小球系膜纖維化增生，膠原纖維蛋白增多，使得系膜增厚，基質(zhì)增多，與（c）圖PAS染色結(jié)果模型組兔腎小球系膜增生，系膜基質(zhì)增厚相一致（圖4,5）。

注：圖a, b分別為模型組和對(duì)照組兔的腎臟Masson染色；c,d分別為模型組和對(duì)照組兔的腎臟PAS染色。

圖4 兔腎臟Masson和PAS染色

圖5 兔腎臟masson和PAS染色單個(gè)腎小球內(nèi)膠原蛋白及糖原面積的百分比

（4）皮膚和肺臟的嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)

嗜酸性粒細(xì)胞的皮膚（圖a,b）和肺臟（圖c,d）Luna染色，表現(xiàn)為單位面積（1mm2 ×40倍）視野內(nèi)模型組兔皮膚真皮層和肺間質(zhì)內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多（圖6,7）。

圖a（模型組），b（對(duì)照組）為皮膚Luna染色；圖c（模型組），d（對(duì)照組）為肺組織Luna染色

圖6 兔皮膚和肺組織的Luna染色

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對(duì)于對(duì)照組

圖7 兔皮膚和肺組織的Luna染色單位面積嗜酸性粒細(xì)胞含量

（三）血尿常規(guī)及便潛血改變

血白細(xì)胞WBC升高，RBC相對(duì)于減少，PLT數(shù)量激發(fā)后無差異性改變，NEU、NEU%均升高，EOS、EOS%升高（圖8）。尿液變稠表面觀察有拉絲現(xiàn)象，氣味大，67%尿蛋白陽(yáng)性，尿紅細(xì)胞陽(yáng)性；實(shí)驗(yàn)前便潛血檢測(cè)陰性，激發(fā)實(shí)驗(yàn)后70%便潛血陽(yáng)性。

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對(duì)于對(duì)照組.

圖8 過敏性紫癜兔模型血常規(guī)改變

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)4～12歲，住院 2～5天的12名患者血常規(guī)檢測(cè)白細(xì)胞（WBC），粒細(xì)胞（Gran），單核細(xì)胞（MONO）及百分比MONO% 明顯增加，分別超出正常范圍的百分比為33.3% (4/12)，25% (3/12)，41.6% (5/12)，33.3% (4/12)。淋巴細(xì)胞百分比（LYMPH%）明顯減少，低于正常參考范圍的比例為25% (3/12)，血小板未見明顯異常改變（表1）。

表1 患者血常規(guī)檢測(cè)

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對(duì)于對(duì)照組.

（四）模型血免疫指標(biāo)改變

HSP兔血清IgA升高，IgG降低，C3，C4減少，IgE無明顯改變（圖9）。外周血CD3+T細(xì)胞數(shù)目減少，CD4+T細(xì)胞減少，CD8+T細(xì)胞增多，CD8+T細(xì)胞所占百分比升高，CD4+T細(xì)胞百分比下降，IL-2水平下降，TNF-α水平升高（圖10）。

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)4～12歲，住院 2～5天的12名患者血清IgA， IgE升高（p<0.01），IgG升高（p<0.05），C3，C4減少（p<0.05）。血CD4+T細(xì)胞百分比下降，CD4/CD8比值下降，IL-4、TNF-α水平升高，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（圖11,12）

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對(duì)于對(duì)照組.

圖9 HSP兔模型血清免疫球蛋白和補(bǔ)體改變 圖11 HSP患者血清免疫球蛋白和補(bǔ)體改變

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對(duì)于對(duì)照組.

圖10 HSP兔模型血免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的改變

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對(duì)于對(duì)照組.

圖11 HSP患者血免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的改變

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.5月齡日本大耳白兔24只，12只雌雄各半為模型組，12只雌雄各半為對(duì)照組，體重1.2～1.4kg，普通級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。

2.模型構(gòu)建

1）過敏體質(zhì)的構(gòu)建

中醫(yī)熱性藥物干姜、蓽茇、胡椒水煎劑以1:1:1的比例混合成15%的水溶液，4℃保存?zhèn)溆?。?dòng)物適應(yīng)1周后，模型組口服給藥，1次/日，連續(xù)3周，對(duì)照組給以等量生理鹽水，其它條件相同。

2）抗原致敏

腹腔注射卵白蛋白生理鹽水與弗氏完全佐劑以1:1比例混合的乳化溶液1 mL，1次/周，連續(xù)3 周。對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水。

3）抗原激發(fā)過敏反應(yīng)

腹腔注射致敏3周后，動(dòng)物耳緣靜脈和皮內(nèi)分別注射1%和0.3%卵白蛋白生理鹽水，激發(fā)過敏反應(yīng)。之后觀察動(dòng)物皮膚紅腫狀況，照相存檔。

四、模型主要鑒定方式

非血小板減少性皮膚紫癜癥狀、血尿常規(guī)和便潛血、病理改變（包括炎癥反應(yīng)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、IgA免疫復(fù)合物沉積等）、血免疫指標(biāo)（血清IgA及相關(guān)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子）等。

一、疾病概況

過敏性紫癜（allegric puprura，AP），又稱亨-舒綜合癥（Henoch-Sch?nlein purpura，HSP），是一種常見的血管變態(tài)反應(yīng)性出血性疾病，以廣泛的小血管炎為病理基礎(chǔ)，皮膚紫癜、消化道粘膜出血、關(guān)節(jié)腫脹和腎炎等癥狀為其主要臨床特征，是兒童中發(fā)病率最高的血管炎性病。流行病學(xué)研究提示，HSP的發(fā)病率為（10~22）/10萬，好發(fā)年齡為3~10歲，并發(fā)癥多，過敏性紫癜性腎炎（Henoch-Sch?nlein purpuranephritis，HSPN）是最嚴(yán)重的并發(fā)癥。該病復(fù)發(fā)率高，病程遷延，患病率逐年升高，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其治療無滿意效果。

鑒于直接進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)的局限性，在很大程度上需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，所以HSP動(dòng)物模型在整個(gè)HSP的研究中具有舉足輕重的作用。目前，關(guān)于過敏性紫癜動(dòng)物模型構(gòu)建的報(bào)道很少，因此對(duì)該病病因、發(fā)病機(jī)制、臨床治療評(píng)價(jià)和藥物開發(fā)在一定程度上受到限制。

二、發(fā)病機(jī)制

病因不明確，一般認(rèn)為與過敏有關(guān)，致敏原可能為食物、感染、藥物、花粉或昆蟲叮咬等，臨床上常不確定。致敏原進(jìn)入機(jī)體刺激漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體，與抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，主要是IgA免疫復(fù)合物，過多的免疫復(fù)合物不易被巨噬細(xì)胞清除，刺激5-羥色胺、組胺等血管活性物質(zhì)釋放，血管壁通透性增加，組織水腫。免疫復(fù)合物在血管壁或腎小球膜上沉積，產(chǎn)生過敏毒素，使中性粒細(xì)胞在沉積處聚集，并釋放蛋白水解酶，局部組織血管損傷加劇，沉積在胃腸黏膜小血管，引起胃腸道出血。該發(fā)病機(jī)制類似于可溶性免疫復(fù)合物引起的III型超敏反應(yīng)。然而在相同條件下，很多人接受相同抗原刺激后，并未發(fā)生過敏性紫癜，而有些人則首次接觸這些抗原刺激即可發(fā)生致敏反應(yīng)，說明患過敏性紫癜的人需具備特異反應(yīng)體質(zhì)，并且研究發(fā)現(xiàn)這種特異反應(yīng)體質(zhì)具有家族傾向性，即基因易感性。