1. 該模型鑒定和評(píng)價(jià)的技術(shù)方法和指標(biāo)體系，符合潰瘍性結(jié)腸炎的病理特點(diǎn)，尤其與潰瘍性結(jié)腸炎反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的臨床特點(diǎn)高度相似。

（1） 疾病活動(dòng)指數(shù)

（2） 結(jié)腸指數(shù)

（3） 結(jié)腸組織大體評(píng)分

（4） HE 染色病理觀察

（5） MPO 酶活性檢測(cè)

2. 與國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

現(xiàn)有的潰瘍性結(jié)腸炎的造模方法有單一化學(xué)法刺激、免疫法、免疫復(fù)合法、基因修飾法。雖然現(xiàn)在建造UC動(dòng)物模型的方法多種多樣，但是依舊存在著或多或少的缺陷。理想模型要簡(jiǎn)單易操作，同時(shí)盡可能全面、準(zhǔn)確的模擬人類(lèi)UC的病理生理學(xué)特點(diǎn)和表現(xiàn)，既要與自發(fā)的炎癥誘因相近，又要符合腸道炎癥進(jìn)展、組織損傷進(jìn)展等，同時(shí)模型病變盡量維持較長(zhǎng)時(shí)間，能盡量反映慢性病變的過(guò)程和特點(diǎn)，以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的需求。而目前尚缺乏能滿(mǎn)足這些要求的模型，且已有模型以急性損傷模型為主。故亟待尋找更好的，具有良好重復(fù)性、穩(wěn)定性，并且操作簡(jiǎn)單的動(dòng)物模型，從而為研究UC發(fā)病機(jī)制、研發(fā)治療新藥物提供良好的基礎(chǔ)。

3. 本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)或技術(shù)關(guān)鍵

3.1 創(chuàng)新點(diǎn)

本模型采用誘導(dǎo)劑聯(lián)用的方法，建立慢性、炎癥維持時(shí)間長(zhǎng)且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 造模方法。該模型改進(jìn)了傳統(tǒng)潰瘍性結(jié)腸炎模型的病程短、穩(wěn)定性差、模型指標(biāo)缺少特異性等問(wèn)題，更大程度的模擬了臨床慢性潰瘍性結(jié)腸炎病理指標(biāo)。

3.2 關(guān)鍵技術(shù)

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸兩種誘導(dǎo)劑聯(lián)用、致敏與感染相結(jié)合的方法，建立了新慢性、炎癥維持時(shí)間長(zhǎng)且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通過(guò)閱讀大量中外文獻(xiàn)，較充分的了解潰瘍性結(jié)腸炎疾病以及模型建立過(guò)程中的問(wèn)題。

4.2 實(shí)驗(yàn)單位具備動(dòng)物飼養(yǎng)許可證以及較先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)器材和檢測(cè)設(shè)備。

4.3 通過(guò)閱讀大量中外文獻(xiàn)和走訪(fǎng)調(diào)研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在臨床上應(yīng)用廣泛，效果明顯，具有可行性。

本實(shí)驗(yàn)采用昆明種6-8周齡的健康成年小鼠，體重均在33±2g，SPF級(jí)。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購(gòu)自北京斯貝福生物科技股份有限公司，動(dòng)物用水為實(shí)驗(yàn)室制UP水經(jīng)過(guò)除菌處理。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均于具有檢驗(yàn)合格資質(zhì)的SPF級(jí)屏障動(dòng)物室內(nèi)進(jìn)行，并且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入屏障實(shí)驗(yàn)室，觀察室適應(yīng)7天后無(wú)異常情況，方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)中小鼠均引頸處死，盡量減少動(dòng)物手術(shù)創(chuàng)傷程度及失血量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

哮喘反應(yīng)（速發(fā)相和遲發(fā)相）、病理改變（包括肺炎細(xì)胞浸潤(rùn)和黏液分泌等）、血免疫指標(biāo)（血清IgE及相關(guān)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子）等。

1.特異性IgE結(jié)果

由表1可以看出，除OVA 0.01組，OVA 0.1、OVA 1、OVA 10、OVA 0.1 + Al(OH)3 100、OVA 1 + Al(OH)3 100、OVA 10 + Al(OH)3 100、OVA 1 + Al(OH)3 52、OVA 1 + Al(OH)3 4、OVA 10 + Al(OH)3 gel 4組血清IgE含量與正常對(duì)照組相比均顯著升高（P < 0.05），且隨OVA劑量增大，IgE含量升高，加入佐劑組比單純OVA組抗體含量高。OVA 10 + Al(OH)3 100組與OVA 10+ Al(OH)3 gel 4組的IgE含量無(wú)顯著差異，均較其他組高，以O(shè)VA 10 + Al(OH)3 100組為最高。如表1、2，OVA 10組與相當(dāng)于其1 % OVA含量但加入了一定佐劑的OVA 0.1+ Al(OH)3 100組產(chǎn)生的抗體含量相當(dāng)，且滴度相同，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從圖1模型組（OVA 10 + Al(OH)3 100組為代表），IgE含量隨時(shí)間變化曲線(xiàn)可以看出，致敏后IgE水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性增長(zhǎng)，在第1周內(nèi)與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異，1周后IgE水平開(kāi)始快速升高，在第2周內(nèi)劇烈增長(zhǎng)，2周后漲幅變緩慢呈現(xiàn)穩(wěn)定的持續(xù)增長(zhǎng)，在第5周達(dá)最高值，d 38時(shí)略有下降。

Fig. 1 The curve of IgEcontent changes over time

圖 1 IgE含量隨時(shí)間變化曲線(xiàn)

Tab. 1The influence of different sensitization methods to day35 IgE content

表1 不同致敏方法對(duì)d 35 IgE含量的影響

Tab. 2The IgE titer of the day 35 sera of OVA 10 and OVA 0.1 + Al(OH)3 100 groups

表2 OVA 10和OVA 0.1 + Al(OH)3 100組d 35的IgE滴度

2.哮喘發(fā)作全過(guò)程記錄結(jié)果

正常對(duì)照組激發(fā)后的Penh曲線(xiàn)在16 h內(nèi)較穩(wěn)定，沒(méi)有明顯波動(dòng)（圖2A）。其Penh限值為1.14（0.90+3*0.08），大于1.14即為Penh值升高。與正常對(duì)照組相比（圖2B），致敏組（OVA 10 + Al(OH)3 100組為代表）激發(fā)后Penh值立即升高，其Penh曲線(xiàn)在前1 h內(nèi)有明顯上升（圖3B）。之后曲線(xiàn)有輕度下降，再開(kāi)始劇烈上升達(dá)峰值后劇烈下降再緩慢下降至基線(xiàn)水平（圖3A）。如表3所示，單一OVA 0.1mg至10mg致敏，激發(fā)后均出現(xiàn)氣道反應(yīng)。低劑量時(shí)僅有EAR，隨劑量增加，反應(yīng)加重，LAR發(fā)生的比例增加。加入Al(OH)3佐劑致敏后反應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)，EAR和LAR都出現(xiàn)的動(dòng)物可達(dá)半數(shù)以上。如表4所示，正常對(duì)照組和OVA 10 + Al(OH)3 100、OVA 10 + Al(OH)3 gel 4組的EAR峰值和LAR峰值都有差異，兩個(gè)模型組沒(méi)有差異。兩個(gè)模型組的EAR面積、LAR持續(xù)時(shí)間、LAR面積也無(wú)明顯差異。OVA 10 + Al(OH)3 100組連續(xù)出現(xiàn)EAR和LAR的動(dòng)物數(shù)為整組6只。

Fig.2 The Penh runningaverage curve of normal control group

圖2 正常對(duì)照組Penh移動(dòng)平均曲線(xiàn)

Fig.3 The Penh runningaverage curve of OVA 10 + Al(OH)3 100 group

圖3 OVA 10 + Al(OH)3 100組Penh移動(dòng)平均曲線(xiàn)

Tab.3The count of EAR and LAR

表3 EAR和LAR反應(yīng)次數(shù)統(tǒng)計(jì)

Tab.4The EAR and LAR of OVA 10 + Al(OH)3 100 and OVA 10 + Al(OH)3 gel 4 groups

表4 OVA 10 + Al(OH)3 100、OVA 10 + Al(OH)3 gel 4組EAR和LAR

3. 肺組織病理檢測(cè)結(jié)果

如圖4與正常對(duì)照組相比（圖4C、D），OVA 10 + Al(OH)3 100組（圖4A、B）顯示血管充血，肺組織有灶性出血，肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)有滲出，分泌物增多（箭頭所示），且以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞也增多，提示造模成功，符合哮喘時(shí)有以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥的特點(diǎn)。

Fig.4 The HE staining ofleft lung on day 38

圖4 第38天左肺HE染色結(jié)果

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)挪威褐鼠，6 ~ 8周齡，體重140 ~ 150 g。

2. 模型構(gòu)建

1）抗原致敏

挪威褐鼠按OVA混合Al(OH)3干粉（10+100mg/只）致敏液于第0天（d 0）和第5天（d5）在每只動(dòng)物背部選取2點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，每點(diǎn)均注射0.2ml。

2）抗原激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)

于致敏后第35天將挪威褐鼠一起放入霧化箱中，霧化箱放入二級(jí)生物安全柜中將5% OVA 5mL加入壓縮霧化吸入機(jī)，霧化吸入10分鐘完成激發(fā)。激發(fā)完成后立即將挪威褐鼠轉(zhuǎn)移至體積描記器中開(kāi)始記錄呼吸參數(shù)，持續(xù)記錄16 h。

一、疾病概況

過(guò)敏性哮喘（以下簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）屬于I型超敏反應(yīng)又被稱(chēng)作變態(tài)反應(yīng)，病變主要表現(xiàn)在肺支氣管，是以可逆性支氣管痙攣和氣道高反應(yīng)性為特點(diǎn)的慢性炎癥。病理表現(xiàn)為以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞在肺組織大量浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞增生、黏液過(guò)度分泌及氣道重塑等。近年來(lái)，世界范圍內(nèi)哮喘發(fā)病率逐年攀升，對(duì)人類(lèi)健康危害極大，哮喘研究日益受到重視，

作為哮喘機(jī)理及藥物等研究的必備工具—?jiǎng)游锬Ｐ桶l(fā)揮著重要的作用，模型的發(fā)展直接影響哮喘研究的進(jìn)步。過(guò)敏性哮喘發(fā)病機(jī)制即I型超敏反應(yīng)是該病模型的造?；A(chǔ)，在此基礎(chǔ)上研究者根據(jù)研究目的選擇不同的模型動(dòng)物，卵蛋白、塵螨、花粉等不同變應(yīng)原，哮喘發(fā)作、氣道高反應(yīng)性等不同階段和氣道阻力、Penh等不同指標(biāo)檢測(cè)方法及麻醉、清醒等不同動(dòng)物生理狀態(tài)，構(gòu)建多種類(lèi)型的模型。目前過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型多樣化且各有利弊，合理的選擇是獲得優(yōu)秀研究成果的保證。

二、發(fā)病機(jī)制

I型超敏反應(yīng)包括致敏和激發(fā)兩個(gè)部分，致敏即機(jī)體首次接觸抗原，激發(fā)即機(jī)體第二次接觸抗原觸發(fā)的反應(yīng)。是指機(jī)體第二次接觸相同抗原后，

首先被樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞上的受體識(shí)別，受體與抗原特異性結(jié)合，產(chǎn)生刺激B細(xì)胞活化的第一信號(hào)，然后胞吞抗原將其內(nèi)化，并進(jìn)行加工處理，抗原降解后產(chǎn)生的抗原肽與MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合，以MHCⅡ類(lèi)分子-抗原肽復(fù)合物的形式提呈給特異性Th細(xì)胞（抗原誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化而來(lái)的Th2細(xì)胞）識(shí)別，Th細(xì)胞活化，表達(dá)CD40L，CD40L與B細(xì)胞表面CD40結(jié)合，向B細(xì)胞提供協(xié)同刺激信號(hào)即B細(xì)胞活化的第二信號(hào)。Th2還能分泌IL-4、IL-5、IL-6促進(jìn)B細(xì)胞活化增殖。B細(xì)胞活化后循兩條途徑分化：漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞。漿細(xì)胞產(chǎn)生IgM，抗原誘導(dǎo)抗體向IgE轉(zhuǎn)換，Th2分泌的IL-4也誘導(dǎo)抗體向IgE轉(zhuǎn)換。IgE與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的高親和性IgE Fc受體結(jié)合，完成致敏過(guò)程。

抗原再次進(jìn)入機(jī)體后，與致敏肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞表面上的IgE抗體結(jié)合，使膜上兩個(gè)相鄰的高親和性IgE Fc受體發(fā)生相互連接，即受體通過(guò)γ鏈C端免疫受體酪氨酸活化基序的磷酸化作用，使Syk和Fyn酪氨酸激酶活化，通過(guò)兩條途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞脫顆粒、釋放及合成生物活性物質(zhì)：（1）使γ異構(gòu)型磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C信號(hào)鏈活化，使胞漿內(nèi)肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而導(dǎo)致脫顆粒、釋放組胺等生物活性介質(zhì)；（2）活化絲裂原啟動(dòng)蛋白激酶信號(hào)通路，使膜磷脂膽堿分解產(chǎn)生花生四烯酸，進(jìn)而通過(guò)環(huán)氧合酶、脂氧合酶途徑合成前列腺素D2和白三烯，使烴基化磷脂分解成溶血血小板活化因子，再經(jīng)乙酰轉(zhuǎn)移酶作用生成血小板活化因子。引起支氣管平滑肌痙攣、血管通透性增強(qiáng)、黏液分泌增多和炎癥細(xì)胞募集等哮喘早期反應(yīng)，即哮喘發(fā)作時(shí)的速發(fā)相（early-phase asthmaticresponse, EAR）， EAR發(fā)生在接觸抗原數(shù)分鐘內(nèi)，一般持續(xù)1-2 h。50%以上的哮喘患者在EAR后會(huì)有遲發(fā)相（late-phase asthmaticresponse, LAR）出現(xiàn)，LAR主要是由炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等浸潤(rùn)，呼吸道上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞等趨化分泌炎性因子，進(jìn)而加重支氣管痙攣和粘膜水腫而使喘息增加，主要是炎癥過(guò)程，可持續(xù)近10 h甚至更久，加重氣道高反應(yīng)性，從而引發(fā)咳嗽、胸悶、呼吸困難和喘息等癥狀