1、MERS-CoV感染絨猴臨床觀察

狨猴經(jīng)氣管插管輔助攻毒后，狨猴表現(xiàn)了明顯的感染癥狀，引起了中度或重度的呼吸道癥狀，甚至出現(xiàn)死亡。主要表現(xiàn)為呼吸頻率增加，活動(dòng)減少，身體蜷縮，飲食量減少，體重降低。特別是攻毒組有兩只狨猴癥狀更明顯。攻毒后3天內(nèi)狨猴體溫下降，白細(xì)胞數(shù)減少，紅細(xì)胞數(shù)變化不明顯。對(duì)照組狨猴無任何臨床。

2、MERS-CoV感染絨猴病理學(xué)檢查

MERS-CoV感染前和感染后1天和3天分別進(jìn)行了肺部X光拍攝，感染前肺部并未觀察到任何變化，感染1天時(shí)肺右下出現(xiàn)陰影，表明肺部有炎癥反應(yīng)。3天時(shí)陰影面積有所增大（圖2A）。感染3天時(shí)，對(duì)剩余的1只攻毒狨猴進(jìn)行了CT拍攝，發(fā)現(xiàn)了肺部出現(xiàn)片狀低密度影，跟X光拍攝結(jié)果類似（圖2B）。攻毒兩天后，1只狨猴死亡，一只執(zhí)行安樂死，大體解剖可見肺部有大面積充血呈暗紅色。剩余1只狨猴于感染后3d執(zhí)行安樂死，大體解剖亦可見肺部有不同程度充血呈暗紅色，其位置跟X光和CT檢查結(jié)果一致（圖2C）。而對(duì)照組肺部無明顯變化。顯微病理檢查可見攻毒組狨猴各個(gè)肺葉均發(fā)生多灶性到融合性滲出性肺炎，肺泡中可見大量滲出的炎性細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主）和纖維素，并發(fā)生肺水腫，局灶肺泡隔顯著增寬，肺泡結(jié)構(gòu)消失，血管擴(kuò)張充血，周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，出血（圖3）。另外腎臟腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，少量腎小管上皮細(xì)胞不同程度變性壞死，有的管腔中可見蛋白管型形成（圖3）。而對(duì)照組無此變化。其它組織未見明顯的病理改變。免疫組化分析表明攻毒組狨猴肺和氣管中可檢測(cè)到病毒蛋白的表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布在Ⅰ型肺泡細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。肺外器官并未檢測(cè)到病毒蛋白的存在。對(duì)照組猴肺中并未檢測(cè)到病毒特異蛋白的存在（圖4）。

3、qRT-PCR方法檢測(cè)拭子和組織樣品病毒載量

攻毒后分別對(duì)拭子樣品和組織樣品進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攻毒組3只狨猴均可在肺部和氣管檢測(cè)到病毒核酸存在。攻毒兩天后死亡的兩只狨猴還在心臟、肝臟、脾臟和腎臟檢測(cè)到病毒核酸的存在，表明存在病毒血癥的可能性。而另一只狨猴并未在肺外組織檢測(cè)到病毒核酸的存在。采集的拭子樣品進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，結(jié)果顯示在攻毒狨猴的肛拭子中均未檢測(cè)到病毒核酸。死亡的2只狨猴均可在攻毒1天時(shí)的咽拭子中檢測(cè)到病毒，但其中僅有一只在鼻拭子中檢測(cè)到病毒核酸。攻毒組另外1只狨猴在鼻拭子和肛拭子并未檢測(cè)到病毒核酸。對(duì)照組狨猴組織和拭子樣品未檢測(cè)到病毒核酸的存在（表1）。

4、 拭子和組織樣品中病毒滴度測(cè)定

對(duì)采集的鼻拭子、咽拭子、肛拭子在Vero細(xì)胞上進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，僅有1只狨猴在攻毒1天時(shí)的咽拭子中檢測(cè)到病毒，滴度可達(dá)103TCID50/ml，該狨猴在攻毒兩天后死亡。其它拭子樣品并未分離到病毒。采集的組織樣品進(jìn)行病毒分離，只在肺部和氣管分離到較高滴度的病毒。其他器官（腎臟、心臟、肝臟、脾臟）并未分離到病毒（圖5）。對(duì)照組狨猴拭子和組織樣品也未分離到病毒。

5、狨猴肺部電鏡觀察

對(duì)感染MERS-CoV病毒的肺組織進(jìn)行透射電鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其胞漿中可觀察到病毒顆粒（圖6），進(jìn)一步證實(shí)病毒可在肺細(xì)胞中復(fù)制。

實(shí)驗(yàn)用狨猴，3-4 歲，雄性，遺傳背景明確。按照國(guó)家微生物和寄生蟲SPF等級(jí)通過檢測(cè)，抗MERS抗體陰性。絨猴在生物安全三級(jí)（BSL-3）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，并按國(guó)家動(dòng)物生物安全標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。

MERS-CoV(hCoV-EMC，GenBank: MH454272.1）由荷蘭伊拉斯姆斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Ron Fouchier 教授饋贈(zèng)。采用支氣管鏡輔助攻毒，攻毒劑量為

6.5×106TCID50/1ml/只。

觀察攻毒后絨猴臨床癥狀，每天兩次。分別于攻毒前1d和攻毒后3d進(jìn)行胸部X光拍攝。攻毒后隨時(shí)觀察狨猴狀態(tài)，一旦評(píng)分超過35 分，即進(jìn)行人道主義安樂死。采集肺、氣管、心、脾、腎、腦、肝臟、腸組織進(jìn)行病理、免疫組化和病毒檢測(cè)。攻毒后分別在1, 3 天采集咽拭子、鼻拭子、肛拭子進(jìn)行病毒檢測(cè)。

2012 年6 月埃及病毒學(xué)家Zaki 從沙特一位患有急性肺炎并伴發(fā)急性腎衰竭的男性患者中分離到了一株冠狀病毒。隨后他把病毒樣本送到了荷蘭鹿特丹伊拉斯姆斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心（Erasmus Medical Center），Ron Fouchier 教授最終證實(shí)的確是一種以前沒有見過的冠狀病毒，命名為 HCoV-EMC，是一種不同于SARS 冠狀病毒(SARS-CoV)的新型冠狀病。

隨后英國(guó)的科學(xué)家也確認(rèn)了一名來本國(guó)就醫(yī)的卡塔爾患者也感染了這種新型冠狀病毒，癥狀亦是嚴(yán)重呼吸綜合征，將該病毒命名為人冠狀病毒-England 1( human coronavirus England 1)。后續(xù)經(jīng)證實(shí)兩病例感染的病毒為同一病毒，序列比對(duì)有99.5%的相似性。

2012 年9 月23 日，世界衛(wèi)生組織發(fā)布公告，確認(rèn)有2 名患者感染了新型冠狀病毒，兩人臨床表現(xiàn)為急性呼吸道感染，并伴有急性腎衰竭。此后幾個(gè)月該病毒在中東地區(qū)接連出現(xiàn)，并出現(xiàn)了小群體傳播事件。另外一些歐洲、美洲、非洲國(guó)家也出現(xiàn)來自中東的輸入病例，分離的毒株也越來越多，并各自命名，比如humanbetacoronavirus 2CJordan-N3、humanbetacoronavirus 2c England-Qatar 等。為統(tǒng)一新型冠狀病毒名稱，方便新型冠狀病毒感染病例的通報(bào)，2013 年5月國(guó)際病毒分類委員會(huì)冠狀病毒研究小組將此新型冠狀病毒命名為中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)。

據(jù)WHO 報(bào)道該病的潛伏期為2-15 天。臨床表現(xiàn)以急性呼吸道感染為主要癥狀。發(fā)病快、高熱、體溫可達(dá)39-40℃，伴有畏寒、寒戰(zhàn)，咳嗽、胸痛、頭痛、全身肌肉關(guān)節(jié)酸痛、乏力、食欲減退等癥狀。在肺炎基礎(chǔ)上，臨床病變進(jìn)展迅速，很快發(fā)展為呼吸衰竭、ARDS 或多器官功能衰竭（MODS），特別是腎功能衰竭，危及生命，少數(shù)病例病情相對(duì)較輕。患者還可能出現(xiàn)消化道癥狀，如腹瀉和胃部不適等；有些患者還會(huì)發(fā)生膿毒性休克，導(dǎo)致死亡。免疫力低下、老年人和伴有慢性?。ㄈ缣悄虿?、癌癥和慢性肺部疾?。┑娜巳焊装l(fā)展為重癥。

影像學(xué)表現(xiàn)：胸部X 光片的結(jié)果和局限性肺炎、ARDS 的結(jié)果一致，如雙側(cè)肺門浸潤(rùn)，單側(cè)或雙側(cè)片狀增厚、分割或肺葉混濁，毛玻璃樣外觀，胸膜積液等。下部肺葉比上部肺葉受損程度更大。CT 掃描則顯示間質(zhì)性浸潤(rùn)和實(shí)病?；颊咄ǔ１憩F(xiàn)為白細(xì)胞減少，尤其是淋巴細(xì)胞減少。另外患者的血、尿及糞便中均能檢測(cè)到病毒RNA，但遠(yuǎn)少于呼吸道內(nèi)的病毒量，且上呼吸道中的病毒量通常也比下呼吸道量少。在一些病患中發(fā)現(xiàn)有其它呼吸道病毒共感染，在機(jī)械通氣的病患中也出現(xiàn)醫(yī)院獲得性細(xì)菌感染。