采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71(NX10-147)經(jīng)腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠,建立重癥小鼠模型,6 dpi重癥模型小鼠發(fā)生后肢癱瘓最終導(dǎo)致死亡;繪制生存率(圖1A),體重增長曲線(圖1B),臨床評分(圖1C)。重癥小鼠模型在5 dpi時,2/7(28.57%)小鼠發(fā)生后肢癱瘓(圖2),在7 dpi時,4/7(57.14%)小鼠表現(xiàn)癱瘓,其體重也下降,11~12 dpi重癥小鼠出現(xiàn)死亡,生存率為71.43%(5/7),其中存活的小鼠中60%(3/5)出現(xiàn)癱瘓后遺癥。
1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測
為了進(jìn)一步探討重癥EV71小鼠模型體內(nèi)病毒載量情況,采用RT-PCR對3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進(jìn)行病毒核酸檢測(圖3),發(fā)現(xiàn)以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測到EV71病毒,其中,檢測到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量(107.0 copies/mg),其中,3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測到低病毒載量(102.0 copies/mg),5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg,說明5 dpi EV71病毒造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg,5 dpi 病毒載量無明顯變化,重癥小鼠模型中均檢測到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量,說明這些組織是病毒復(fù)制并傳播到腦組織的重要部位。
2.重癥小鼠模型組織病理學(xué)變化
運(yùn)用組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù),對重癥小鼠模型的各組織器官進(jìn)行病理學(xué)觀察??瞻讓φ战M小鼠未見明顯病理變化,并且EV71抗原呈陰性反應(yīng)。
對重癥小鼠模型(NX10-147)進(jìn)行組織病理學(xué)觀察(圖4),發(fā)現(xiàn)3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發(fā)生嚴(yán)重的壞死性肌炎,肌纖維斷裂,大量炎性細(xì)胞浸潤,主要有淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞;3 dpi 小鼠脊髓和腦干發(fā)生細(xì)胞源性水腫,神經(jīng)元發(fā)生變性,偶見壞死,5 dpi小鼠脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元變性壞死,出現(xiàn)紅色神經(jīng)元,并可見衛(wèi)星現(xiàn)象和嗜神經(jīng)現(xiàn)象,腦干組織中的神經(jīng)元發(fā)生不同程度的變性壞死,并且可見腦干和脊髓神經(jīng)元中的尼氏小體消失;5 dpi肺臟發(fā)生大面積間質(zhì)性肺炎,間質(zhì)增寬,炎性細(xì)胞浸潤,肺泡間隔毛細(xì)血管淤血,3 dpi和5 dpi肺臟發(fā)生局灶性肺氣腫;3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生大面積空泡變性。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)在上述嚴(yán)重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布(圖5),在3dpi和5 dpi時,脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測到較強(qiáng)的陽性EV71抗原信號,提示在這些組織中病毒復(fù)制活躍,然而在5 dpi時,肺臟檢測到中等強(qiáng)度陽性EV71抗原信號。
3.重癥小鼠模型血清細(xì)胞因子檢測
對重癥小鼠模型進(jìn)行血清細(xì)胞因子檢測從血清細(xì)胞因子方面揭示重癥發(fā)生機(jī)制。本研究采用CBA方法檢測了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ,以及MCP-1、CCL5/RANTES的動態(tài)變化(圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些血清因子中,IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發(fā)生某時間點(diǎn)的爆發(fā)性濃度增高,與空白對照組小鼠血清因子相比,發(fā)現(xiàn)重癥小鼠血清爆發(fā)性增高的細(xì)胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調(diào)4倍;48 hpi重癥IL-13上調(diào)1.2倍;3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調(diào)100倍以上;3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調(diào)9倍和10倍;重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時達(dá)到峰值,重癥為10倍;7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調(diào)4倍和87倍。以上數(shù)據(jù)說明,IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實(shí)驗(yàn)感染早期炎癥反應(yīng)的主要因素,并且細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實(shí)驗(yàn)感染的免疫病理損傷中發(fā)揮重要作用。
4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血?dú)夥治?/strong>
對小鼠的氣道阻力進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)小鼠的吸氣時間延長,呼吸頻率降低,分鐘通氣量顯著降低(圖7),符合限制性通氣不足的特征,可能是小鼠死亡的主要原因之一。
采用血?dú)夥治龇椒▽V71重癥小鼠模型組和對照組小鼠的呼吸效果進(jìn)行分析,與對照組相比,4 dpi感染組小鼠的氧分壓(PO2)和氧飽和度(sO2)均明顯下降,PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg,差異極顯著(p < 0.01)(圖8A);sO2由90.6 %下降到76.5 %,差異極顯著(p< 0.01)(圖8B),PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態(tài)。并且發(fā)現(xiàn)二氧化碳分壓(PCO2)和二氧化碳總量(TCO2)有所上升,PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg,差異顯著(p< 0.05)(圖8D);TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L(圖8E),PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了血液酸堿度pH值和細(xì)胞外液堿剩余(BEecf)均明顯下降,pH值由7.42下降到7.33,差異顯著(p< 0.05)(圖8C);BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L,差異顯著(p < 0.05)(圖8F),提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態(tài)。以上血?dú)饨Y(jié)果結(jié)合肺臟組織病理變化,說明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下,處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態(tài)。
5. EV71小鼠模型超微病理學(xué)變化
對照組小鼠肌肉組織可見橫紋明顯,每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列,肌質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復(fù)合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內(nèi)含物,糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中(圖9A),肌細(xì)胞內(nèi)可見清晰的線粒體,或在肌纖維間排列,其內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰可見(圖9B)。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯,表現(xiàn)為肌組織橫紋消失,明暗帶模糊甚至消失,肌組織發(fā)生退行性變,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)水腫,部分肌原纖維發(fā)生溶解,肌質(zhì)中的胞漿內(nèi)容物減少,糖原顆粒甚至消失(圖9C);線粒體腫脹、空化,基質(zhì)電子密度降低,內(nèi)室腫脹,嵴和膜結(jié)構(gòu)模糊,嵴突變短減少,崩解消失,形成灶性空化;骨骼肌細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)邊集,異染色質(zhì)明顯增多,發(fā)生變性、壞死。并且在肌纖維間可見巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。
對照組腦組織中神經(jīng)元胞漿中的細(xì)胞器豐富,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá),平行或不規(guī)則排列,其間游離存在核糖體(圖10A);線粒體豐富,散布于整個胞體中,線粒體內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰(圖10B);腦組織中有髓神經(jīng)纖維髓鞘電子密度均勻(圖10C)。感染組腦組織超微病變輕微,神經(jīng)元細(xì)胞器豐富,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá),線粒體豐富;神經(jīng)元胞漿中可見少量空泡,部分線粒體內(nèi)室腫脹(圖10E);有髓神經(jīng)纖維髓鞘發(fā)生層面分離,導(dǎo)致小泡性分離,呈現(xiàn)泡狀改變(圖10F)。
對照組脊髓前角神經(jīng)元常染色質(zhì)明顯,異染色質(zhì)少,細(xì)胞器豐富(圖11A);脊髓前角神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體豐富,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)(圖11B)。感染組脊髓前角神經(jīng)元中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,出現(xiàn)尼氏小體溶解,核周見微空泡形成;胞核皺縮,異染色質(zhì)增多,細(xì)胞器減少,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體呈現(xiàn)不同程度的擴(kuò)張,細(xì)胞質(zhì)呈篩狀外觀,并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失,導(dǎo)致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒;線粒體腫脹,線粒體嵴突腫脹,嵴數(shù)量減少(圖11C)。小膠質(zhì)細(xì)胞包圍吞噬神經(jīng)元細(xì)胞,呈現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象(圖11D)。
對照組肺組織中I型上皮細(xì)胞扁平,其細(xì)胞核內(nèi)可見呈淺亮的常染色質(zhì)和呈深色顆粒狀的異染色質(zhì),胞質(zhì)少而薄,胞漿內(nèi)可見少量細(xì)胞器,與周圍細(xì)胞連接緊密(圖12A);肺組織中的II型上皮細(xì)胞核大而圓,常染色質(zhì)細(xì)密,異染色質(zhì)少,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、溶酶體等細(xì)胞器豐富(圖12B);II型上皮細(xì)胞胞漿中可見清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體(圖12C)。感染組肺組織中I型上皮細(xì)胞核中染色質(zhì)邊集,呈不規(guī)則堆積,并且與周圍細(xì)胞之間連接松弛(圖12D);肺組織中II型上皮細(xì)胞核形狀不規(guī)則,染色質(zhì)邊集,核周細(xì)胞質(zhì)電子密度降低,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器減少,胞質(zhì)出現(xiàn)細(xì)小空泡變,嗜鋨性板層小體或出現(xiàn)排空現(xiàn)象,溶酶體增多(圖12F);肺泡壁中的細(xì)胞成分增多,其中肺泡II型上皮細(xì)胞增生,發(fā)生了間質(zhì)性肺炎。
H1PV為低于人間傳染病名錄三級安全風(fēng)險的病原,人類感染風(fēng)險低。
H1PV是大鼠必須排除的病原體,對動物有致病性。會干擾其他實(shí)驗(yàn)研究。
鑒于此,此感染實(shí)驗(yàn)必須在BSL-2級以上的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)實(shí)驗(yàn),在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。
重癥EV71小鼠模型臨床癥狀可隨著感染時間增加,表現(xiàn)為豎毛、后肢癱瘓,甚至死亡。
2.1 病毒培養(yǎng)
2.1.1 細(xì)胞株
橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)。
2.1.2 實(shí)驗(yàn)動物
SPF級9日齡BALB/c乳鼠,每窩5 ~ 7只,母鼠自然哺乳。
2.1.3 病毒
EV71臨床分離株基本信息見表1。
表1. EV71臨床分離株基本信息
2.1.4 病毒培養(yǎng)與病毒TCID50的測定
RD細(xì)胞貼壁覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶生長成單層后,分別接種EV71病毒株,24 hpi觀察細(xì)胞形態(tài),待90%的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變時,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于–80℃冰箱中,并反復(fù)凍融3次后,經(jīng)離心后分裝病毒液并低溫保存。采用常規(guī)方法測定TCID50。在BSL-2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2.2重癥EV71小鼠模型建立
根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定攻毒量,建立重癥EV71小鼠模型,9日齡BALB/c乳鼠輕度麻醉后,經(jīng)腹腔注射104.5 TCID50臨床分離株NX10-147(GenBank登錄號KJ004556),攻毒劑量為250 μl/只;空白對照組乳鼠(n=12)腹腔注射等量RD細(xì)胞上清,其中3只取其血清作為對照組血清。分別在3、6、12 hpi 和1、2、3、5、7、9 dpi采集每組各3只乳鼠血清以備檢測血清中的細(xì)胞因子。在3 dpi和5 dpi每組各剖殺3只乳鼠,立即取其腦干、脊髓、肺臟、后肢骨骼肌和空腸固定在4 %多聚甲醛中,以備組織病理學(xué)檢測;同時,每組另剖殺3只乳鼠取以上組織凍存,以備病毒RNA提取和組織內(nèi)病毒載量測定。
手足口?。╤and, foot, and mouth disease, HFMD)是由腸道病毒引起的,以發(fā)熱和手、足、口腔、臀部等部位出現(xiàn)皮疹、皰疹或皰疹性咽峽炎為主要特征的一種常見于小兒的急性傳染病。手足口病多發(fā)生于入學(xué)前兒童,尤其是3歲以內(nèi)的嬰幼兒,少數(shù)患者會發(fā)展為重癥,并發(fā)無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、急性弛緩性麻痹和心肌炎等,死亡率和致殘率較高。腸道病毒71型(enterovirus71, EV71)是導(dǎo)致手足口病暴發(fā)的主要病原體,是一種高度嗜神經(jīng)病毒,易導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)感染,發(fā)展成重癥,對重癥死亡患者尸檢表明腦干是其最易感染的部位,因此,重癥手足口病患者表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,以及肺出血、循環(huán)障礙、心臟損害等。
EV71感染主要引起患者發(fā)生手足口病,臨床表現(xiàn)與柯薩奇病毒等其他腸道病毒感染引起的手足口病難以區(qū)別,但EV71感染還能引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心功能衰竭等嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病和并發(fā)癥。
EV71主要通過糞口途徑傳播,最初EV71病毒定植于鼻咽部或胃腸局部黏膜,侵入淋巴組織并在其中繁殖,并引起第一次病毒血癥,若機(jī)體免疫力差,則EV71可擴(kuò)散入侵全身網(wǎng)狀內(nèi)皮組織、深層淋巴結(jié)、肝、脾、骨髓等組織器官,大量繁殖后再次入血,引起第二次病毒血癥,EV71最終可侵入靶器官細(xì)胞,如腦、腦膜、脊髓、心肌、橫紋肌以及皮膚黏膜等組織,引起重癥病變,導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害。對手足口病重癥死亡病例進(jìn)行尸體剖檢,發(fā)現(xiàn)腦組織尤其是腦干中的病變最為嚴(yán)重,表現(xiàn)為神經(jīng)元壞死、腦軟化、嗜神經(jīng)現(xiàn)象、膠質(zhì)結(jié)節(jié)和血管袖套等病毒性腦炎的病理改變,這與腸道病毒的神經(jīng)嗜性相符。一般認(rèn)為間腦、中腦、腦橋、延髓是主要的病理靶區(qū)。EV71感染患者血清和腦脊液中有高水平的IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)。重癥EV71感染還可引起嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥,導(dǎo)致嚴(yán)重心肺衰竭而導(dǎo)致死亡,這可能也歸咎于神經(jīng)系統(tǒng)感染及全身炎癥反應(yīng)。
一些特定的臨床指征也可以成為EV71重癥感染患者早期預(yù)警指標(biāo),其中,主要是屬于神經(jīng)系統(tǒng)癥狀指征,如肢體癱瘓、嗜睡、精神差、驚跳等,也包括呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)癥狀。對EV71手足口病進(jìn)行臨床特征回顧性分析,發(fā)現(xiàn)重癥手足口病多發(fā)生于3歲以下兒童,有發(fā)熱和皮疹,外周血白細(xì)胞計數(shù)升高、中性粒細(xì)胞比例升高,血糖升高,神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)以精神差、驚跳、肢體抖動最為常見,危重病例有循環(huán)和呼吸系統(tǒng)異常表現(xiàn)。重型病轉(zhuǎn)化為危重型病有11個預(yù)警征兆,即布氏癥、肢體癱瘓、肺部痰鳴音、腱反射減弱或消失、瞳孔對光反射消失、四肢發(fā)涼、嗜睡、精神差、呼吸節(jié)律改變、心率加快、手足抖動。高血糖、白細(xì)胞增多和肢體癱瘓是神經(jīng)源性肺水腫的危險因素,其中高血糖,尤其是患者的血糖值高于8.3mmol/L,是最能夠預(yù)測病情發(fā)展的臨床指標(biāo),并且,所有出現(xiàn)肺水腫的患者均有高血糖的征兆。
中文名稱:腸道病毒71型BALB/c小鼠模型
英文名稱:EV71 BALB/c mouse model
類型:腸道病毒71型動物模型
分級:NA
用途:用于手足口病研究。
研制單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所
保存單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所
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