1.該模型制備比較成熟，國內(nèi)外都有此模型，構(gòu)建和評價指標(biāo)一致，所以該模型應(yīng)用廣泛，具有統(tǒng)一的操作規(guī)程。

2. 該模型制備的關(guān)鍵：1）小鼠必須是重度免疫缺陷的，而且飼養(yǎng)環(huán)境必須潔凈；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系統(tǒng)，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的臨床癥狀，所以具有很高的比較醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。

1、 臨床癥狀

感染SHIV-KB9病毒后，A0425在感染后第120天出現(xiàn)食欲不振、水樣腹瀉、掉毛和體重減輕，到感染后第130天發(fā)展至嚴(yán)重水樣腹瀉，至18周后，愈發(fā)虛弱，直至感染后149天瀕臨死亡，動物安樂處死，并按計劃取材留樣。其余感染猴未出現(xiàn)皮疹、體重下降、食欲不振、機會性感染等典型的艾滋病癥狀。

2、 SHIV-KB9靜脈感染恒河猴外周血病毒載量結(jié)果

在血漿病毒載量方面，A423和A424在感染后第7天首次出現(xiàn)陽性，之后載量上升，A423于感染后第14天達(dá)到它的最高峰（9.62×107 copies/mL），之后緩慢下降，但在我們的觀察期（161天）內(nèi)，一直維持在103 copies水平之上。A424在感染后第10天達(dá)到一個高峰（5.333×105 copies/mL），之后在103-106之間波動，到感染后第56天達(dá)到它的另外一個高峰（6.082×106 copies/mL），后在我們的觀察期內(nèi)未檢測到病毒載量。A0425病毒載量在28天為7.22×105copies/mL，35天達(dá)到高峰3.51×108 copies/mL，隨后下降，至10w降到了104 copies/mL，之后出現(xiàn)反彈，達(dá)到4.11×106 copies/mL，并長期維持在這個水平上直至發(fā)病。A426動物在整個實驗期間，未檢測到血漿病毒載量陽性（圖1）。

圖1 SHIV-KB9靜脈感染中國恒河猴外周血病毒載量結(jié)果

Fig.1 Theviremia (viral RNA copies/ml plasma) in Chinese-original rhesus macaquesinfected intravenously with SHIV-KB9

1、 SHIV-KB9靜脈感染恒河猴CD4+/CD8+比值結(jié)果

四只實驗猴CD4+/CD8+比例結(jié)果顯示，實驗前，其比值均大于1。接種病毒后，A423-A425在感染后前5周有個下降－回升－再下降的過程，其中A423于感染后21天降至最低值0.15，之后緩慢回升，在161天之前都在0.5之下徘徊，之后進(jìn)入波動期，在0.26-0.78之間波動，但總體趨勢是上升的，并于感染后357天回升至1.08。A424在前五周有幾個幅度較大的波動，并于感染后35天達(dá)到最低點0.48，之后緩慢回升，從第35天的0.48一直波動回升到第329天的1.67。A425的初始CD4+/CD8+比值是四只猴中最高的，它在感染后第35天CD4+/CD8+比值達(dá)到最低點0.0125，之后緩慢回升，但一直維持在0.2以下，直至安樂處死。 A426的CD4+/CD8+比值在前三個月一直未見異常變化，到感染后91天出現(xiàn)下降，之后回升，維持于1附近（圖2）。

圖2 SHIV-KB9靜脈感染中國恒河猴外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio ofT lymphocytes in Chinese-originalrhesus macaques infected intravenously with SHIV-KB9

SHIV-KB9靜脈感染恒河猴CD4+細(xì)胞絕對數(shù)結(jié)果

病毒感染前，A4023-A0426四只猴的CD4+ T細(xì)胞絕對數(shù)都在1000個/μL以上。SHIV-KB9感染后，四只猴在感染后前三周都有個上升－下降－再上升－再下降的過程，（圖3）。A0423在感染后21天到達(dá)最低點每μL血液中244個CD4+細(xì)胞，之后緩慢上升，到感染后203天超過1000個/μL。A0424在感染后28天到達(dá)最低點每μL血液中418個CD4+細(xì)胞，之后波動上升，到感染7周之后超過1000個/μL。A0425對SHIV-KB9的反應(yīng)最強烈，在感染后3天它的CD4+ T細(xì)胞絕對數(shù)從最初的1073個/μL，迅速升到4270個/μL，到第10天更是升至5254個/μL，之后迅速下降，到感染后35天降為16個/μL，并維持這個水平一直到安樂。A0426也是在感染后28天到達(dá)最低點每μL血液中465個CD4+細(xì)胞，之后波動上升，到感染11周之后超過1000個/μL。

圖3 SHIV-KB9靜脈感染中國恒河猴外周血CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)

Fig.3 The CD4+ T cell counts(per l blood) in Chinese-original rhesus macaques infected intravenously with SHIV-KB9

1、 實驗用病毒：感染毒株為SHIV-KB9中國恒河猴細(xì)胞適應(yīng)株，RT-PCR測定病毒拷貝數(shù)為4.8×108copies/mL。

2、 感染動物：選用體重4-6kg的SPF恒河猴。實驗前體檢無異常，必須排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相關(guān)的4種基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）篩查結(jié)果為陰性。所有感染動物必須在ABSL-3室中進(jìn)行。

3、 感染方法：4只恒河猴編號分別為A0423、A0424、A0425和A0426。病毒原液依次用無血清1640培養(yǎng)液做10倍系列稀釋。經(jīng)后肢靜脈感染，每只猴注射1mL稀釋好的病毒液。A0423-A0426分別注射10-1-10-4病毒液1mL。持續(xù)測定8個月。

4、 SHIV-KB9靜脈感染猴樣品采集和指標(biāo)測定：在感染前和感染后3、7、10、14、17、21、28、35、42、49、56、70及84天采集猴靜脈血6mL，3mL EDTA抗凝，用于病毒載量和CD4+/CD8+值測定。

5、 SHIV-KB9靜脈感染猴血漿病毒載量的測定：提取EDTA抗凝血漿中病毒RNA，使用SYBR Green I 實時熒光定量RT-PCR方法測定血漿病毒載量。

6、 SHIV-KB9靜脈感染猴外周血CD4+/CD8+比值及絕對數(shù)測定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗體標(biāo)記EDTA抗凝全血淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定CD4+/CD8+比值，并根據(jù)血常規(guī)結(jié)果，計算出CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)。

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病，是20世紀(jì)危害人類健康和生命最嚴(yán)重的病毒性疾病之一。自美國CDC報道首例艾滋病后，到20世紀(jì)80年代中期艾滋病發(fā)展成為一個性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690萬人，2014年新增感染者200萬，2014年因艾滋病死亡120萬人。艾滋病在1985年傳入我國，截至2015年5月31日，歷年累計報告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成為關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會熱點問題，艾滋病的預(yù)防與治療也成為當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)研究的前沿?zé)狳c之一。

二、艾滋病動物模型簡介

艾滋病發(fā)病機制研究、藥物和疫苗的保護(hù)性研究及評價等方面在很大程度上依賴?yán)硐氲膭游锬Ｐ?。SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被廣泛接受和應(yīng)用，表現(xiàn)為和AIDS的臨床表征，發(fā)病過程、免疫缺陷特征等非常相似。然而，由于HIV與SIV畢竟是兩種不同的病毒，它們在基因序列、包膜結(jié)構(gòu)和抗原性之間存在一定差異，使該模型的使用有一定的局限性。近年來，人們應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，將HIV-1重要基因與SIV做成嵌合體病毒（SIV/HIV-1，簡稱為SHIV）感染恒河猴，用以研究HIV不同基因的功能以及病毒與宿主的相互作用。

Reimann等人以SIVmac239病毒基因組和B亞型HIV-1病毒的env基因為主體構(gòu)建的一株嵌合病毒，即SHIV-89.6，經(jīng)動物體內(nèi)傳代及克隆得到SHIV-KB9。由于在中國流行的8種類型毒株中，B'亞型是我國目前主要流行的HIV-1亞型，占47.5%。我國HIV-1B'亞型毒株與B.TH.92.92TH014最為接近，中國HIV-1B'亞型標(biāo)準(zhǔn)株的核苷酸序列與國際常用HMA分型的TH14、IND868、MA959、TH22等序列比較，相應(yīng)亞型的核苷酸同源性是：B亞型90.2%,88.3%，說明B亞型和B'亞型之間存在很高的親緣性。因此，SHIV-KB9病毒建立的動物模型，對我國的艾滋病疫苗以及疫苗評價和應(yīng)用意義重大，為我國的疫苗研制提供很好的研究和評價平臺。

艾滋病的三種傳播途徑分別是經(jīng)血液、性和母嬰傳播，性傳播包括同性傳播和異性傳播兩種方式。艾滋病動物模型的制備首先要考慮其實際應(yīng)用價值，最好的動物模型可以最大限度的模擬人類疾病，包括使用與自然感染相同或接近的方式建立模型。為充分模擬靜脈注射吸毒人群的感染方式，通過靜脈途徑，病毒直接感染血液中的靶細(xì)胞，從而制備靜脈途徑艾滋病恒河猴感染模型。